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《第四军医大学》 2004年
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Angiostatin对膀胱肿瘤新生血管抑制作用的实验研究

郑凯  
【摘要】:血管生成(angiogenesis)是指从已存在的血管床中产生出新生血管系统的复杂过程。正常血管形成被严格限定于某些特定短暂的生理过程,如胚胎发生、伤口愈合、女性月经期和妊娠期等,血管内皮细胞经过短暂的增殖后很快回到正常的静止状态。而持续的血管生成则是某些病理改变的特征,如慢性炎症、糖尿病性视网膜病变和肿瘤等,由于正常的血管生成调控机制失衡,血管生成变得十分活跃,这是疾病状态得以维持、延续和发展的基础。研究表明,实体肿瘤的生长不仅具有血管依赖性,而且在肿瘤转移过程中,血管生成也起着至关重要的作用。肿瘤形成早期(血管前期),没有血管生长,此期肿瘤不超过0.4mm~3,呈缓慢的线性生长。当肿瘤大小超过0.4mm~3时(血管期),肿瘤开始形成自身的血管系统,肿瘤生长加速,呈快速的近指数生长。因此,在“血管期”抑制肿瘤血管生成,切断肿瘤营养“供给线”,就能控制其生长和转移。抗血管生成治疗现已成为治疗肿瘤的研究热点。随着基因技术的迅速发展,血管治疗与基因治疗的结合应用在肿瘤治疗中显示出广阔的应用前景。 膀胱肿瘤是严重危害人类生命和健康的常见实体瘤之一,临床上虽采取积极的手术治疗,并辅以放疗和化疗,但疗效不佳,死亡率较高,迫切需要开展新的治疗方法,以改善患者预后。尽管目前已开展了多种膀胱肿瘤的生物治疗方案,如过继免疫疗法、免疫导向疗法、细胞因子疗法、肿瘤疫苗、单克隆抗体及其交链物、基因治疗、基因重组药物等,但由于膀胱肿瘤细胞具有高度异质性和遗传突变性,往往使针对肿瘤细胞的生物治疗出现耐药性和毒副作用,严重影响了疗效。采用抗血管生成治疗膀胱肿瘤,具有其独特优势:1.内皮细胞较少变异,是遗传稳定的治疗靶;2.不产生耐药性;3.毒副作用小。抗血管生成治疗已有近30年历史,近十年来 第四军医大学博士论文 在血,管生成抑制因子研究方面取得了较大进展。 .Angiostatin是o’Reiliy等在1 994年研究小鼠低转移型路易氏肺癌(Lewis lung eareinoma-low metastase,LLe一LM)的皮下肿瘤时发现的。经研究证实angiostatin是 纤维蛋白溶酶原(Plasminogell,Pgn)的氮末端序列,由Pgn的前4个kringles(K) 区组成。angiostatin可抑制多种实体瘤血管生成和肿瘤生长,显示了良好的临床应 用前景。目前,在治疗肿瘤过程中,多采用angisotatin及其片段的蛋白形式,需要 剂量较大(最大用至IOom叭g),国外多以真核细胞(杆状病毒)表达angiostatin 及其片段,过程烦琐,表达量较低,难以满足临床需要。为克服上述不足,本课题 进行了以下研究: l目的l:探讨膀肤肿瘤患者血液及尿液中血管抑素含量与膀胧癌发展、转移、 疗效及预后的关系及抗血管生成基因治疗人膀肤肿瘤的可行性。 I方法l: 1.采用赖氨酸一酶联免疫吸附分析(切sine一ELISA)法检测膀肤移行细胞癌患 者治疗前血清及尿液中血管抑素(angiostatin)的水平,以及治疗后血清中血管抑 素的水平。 2.应用RT一PCR方法,以人胚胎肝细胞RNA为模板扩增获得含信号肤序列的 劫git)statin基因片段,并将此基因片段构建在PcDNA3 .1(+)载体上; 3.利用脂质体基因转染技术将含人angiostatin基因片段的真核表达载体 peDNA3 .1(+)一angiostatin转染入人膀肤肿瘤Blu一87细胞中,G4 15筛选,获得阳性 克隆。 4.检测angiostatin转染的人膀肤肿瘤BIU一87细胞的生物学特性及体内外抑 制血管的活性。 [结果]: 1.膀肤移行细胞癌患者治疗前血清及尿液中血管抑素的水平明显高于正常对 照组(尸0.01),并与肿瘤大小、临床分期、分级及有无远处转移密切相关。膀耽 移行细胞癌患者治疗后24h血清中血管抑素的水平并无显著降低(P0.05),治疗 后1周血管抑素水平明显降低,与治疗前差异显著(尸0.01)。 兰州军区总医院全军泌尿外科中心 2.经酶切和序列测定,表明人血管抑素基因已成功地克隆入真核表达载体 peDNA3 .1(+),其阅读框正确,为人纤溶酶原(Pgn)N一末端的如ngles(l一4)片段, 约1 Ikb。 3.采用原位杂交和RT一PcR等方法证实己成功地将PcDNA3.l.Angiostatin转 染入BIU一87细胞;westem blot、免疫组化、免疫荧光等方法证实Angiostatin基因 在实验组BIU一87膀肤肿瘤细胞中获得表达。 4.比较实验组、空载体组和对照组瘤细胞的生物学活性,发现上述三组体外 培养的瘤细胞在超微结构、细胞周期和细胞生长速度上无显著差异(P0.05)。表 明血管抑素对人膀肤肿瘤细胞BIU一87本身生长无抑制作用。 5.脐静脉内皮细胞抑制实验(meth贝thiazol尹tetraZolium,MTT)和鸡胚尿囊 膜血管生成抑制实验(chick embryo chorioallantoic membrane,cAM)证实,在体 外,该蛋白可抑制脐静脉血管内皮细胞生长;在体内,可抑制鸡胚血管生成。 I结论l: 以上结果说明,膀耽移行细胞癌患者血液和尿液中血管抑素的水平在一定程度 上可以反应膀肤移行细胞癌的发展及治疗情况。血管抑素angiostatin cDNA对Blu- 87瘤细胞本身的生长无明显影响;在体外,其分泌的蛋白可抑制脐静脉血管内皮细 胞生长;在体内,可抑制鸡胚血管生成。该结果说明,Angiostatin是一
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R737.14

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