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《第四军医大学》 2004年
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Linker插入的乙肝病毒靶向核糖核酸酶的构建及其抗病毒活性的研究

宫卫东  
【摘要】:HBV感染是当今最严重的健康问题之一,常会引起慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌。目前主要的预防策略是接种疫苗,但有5%的人对疫苗不反应。 目前针对HBV感染的治疗有四大类方法:1)α-干扰素。其有效率仅为30%—40%;2)核苷类抗病毒药物。如拉米呋啶、泛昔洛韦等需长期用药,而长期用药可诱导HBV产生耐药性;3)免疫学治疗。慢性乙肝的发生与细胞免疫功能不全有关。应用免疫学的方法来阻止感染后免疫耐受的产生,包括治疗性疫苗,免疫活细胞移植及免疫细胞因子。但这些手段均处于实验阶段;4)基因治疗。如核酶、反义寡核苷酸、显性负性突变体及siRNA等,这些方法也均是在细胞模型或动物模型体内进行,离临床应用尚有漫长的道路。总之,现有的各种手段对于预防和治疗乙肝病毒的感染有一定的效果,但仍迫切需要探索治疗的新方法。 本研究室根据核衣壳导向的病毒灭活(CTVI)这一抗病毒策略设计了HBVc与hEDN的融合蛋白,即靶向核糖核酸酶(targeted-ribonuclease,TR), 第四军医大学博士学位论文 在体外细胞模型用真核表达载体peDNA3 .l(一)转染已成功地抑制了乙肝病 毒的复制。为进一步探索提高TR的抗HBV效率,我们在HBVc和hEDN 之间引入了经典的linker一一(Gly4Ser)3,即为TR一L,以期通过更好地维 持两个功能域HBVc和hEDN的天然构象,减低它们的空间位阻来增强 融合蛋白的抑制效率。同时为了进一步将其应用于小动物模型,并为将来 可能的临床应用作准备,本研究中还构建了TR一L的重组腺病毒载体RAd, 并在细胞模型上检测了其抗HBV的效率。 首先,将合成的两条寡聚核昔酸链退火形成hnker,克隆入 peDNA3 .1C)汀R中形成peDNA3.l介)舰Be一linker质粒。以peDNA3.l〔)/TR 为模板,PeR扩增hEnN并克隆入peDNA3.lC)舰Be一linker形成 peDNA3.l卜)舰Be一L一hEDN质粒[peDNA3.l〔)/TR一L』,即为有linker插入的 乙肝病毒靶向核糖核酸酶真核表达载体。其中靶向分子HBVc与效应分子 hEDN之间为hnke:隔开。经转染2.2.巧细胞后,IFA显示,转染 peDNA3.1(~)汀又一L的2.2.巧细胞出现较强绿色荧光,说明peDNA3.1(.)汀R.L 在2.2.巧细胞内有表达。转染peDNA3.1(.)几又.L、peDNA3.1(.)厅R、 peDNA3.l(.班卫mut、PcDNA3.l(一)舰BVc、peDNA3.1(.冲£ DN以及空载体 peDNA3.l(一)至2.2.巧细胞同时设立空转染为全阴性对照,48小时后取细胞 上清,应用犯A测定HBsAg、HBeAg含量:TR~L及仪组的细胞上清中 HBsAg、HBeAg的浓度与其它对照组相比有明显下降(尸0.01),各对照 组细胞上清中浓度差异没有统计学意义(P.05);TR-L组与TR组相比 有差异(尸0.05)。TR一L组与空转染组相比,上清中HBsAg、HBeAg的 浓度分别下降了 51 .9%、61.4%。荧光定量PCR法测定上清HBV-DNA含 量显示:实验组细胞上清中HBV-DNA的含量与对照组相比有明显下降 (尸0.01),各对照组细胞上清中含量差异没有统计学意义(p.05):TR.L 组与TR组相比有差异(P0.05)。TR一L组与空转染组相比,浓度下降了 49.9%。各组转染后观察细胞形态无明显变化,M仃比色分析显示,各组 4 第四军医大学博士学位论文 间差别无统计学意义(P0.05),说明细胞增殖并没有受抑制。 为了更好的观察和证实我们构建的乙肝病毒靶向核糖核酸酶在体内 的作用,本实验换用重组腺病毒载体RAd为后续的体内试验及功能研究 打下基础。 首先构建带目的片段的腺病毒穿梭质粒,将各目的片段TR一L、TR、 TRlnut、HBVe、hEDN,克隆入腺病毒穿梭质粒pDC3 16。在293细胞中 包装形成含目的片段重组腺病毒、鉴定、扩增及滴度测定。获得的各病毒 滴度分别为(107p细ml):RA出TR一L:4.1:RA价R:4.5;KA盯Rxnut: 3.7:RAd儿EDN:5.6:RA出HBVc:6.3:RA出空:5.7。用获得的重组腺 病毒感染2.2.巧细胞后,IFA显示,感染RAdjTR一L的2.2.巧细胞出现较强 绿色荧光,说明RA山叮R一L在2.2.巧细胞内有表达。以重组腺病毒分别感染 2.2.巧细胞,同时设立空感染为全阴性对照,48小时后提取细胞上清,应 用IUA测定HBsAg、HBeAg含量显示,RAd/TR一L及RA山丁R细胞上清中 HBsAg、HBeAg的浓度与其它对照组相比有明显下降(尸0.01),各对照 组浓度差异没有统计学意义(P.05):TR一L组与TR组相比有差异 (尸0.05)。TR一L组与空感染组相比,上清中HBsAg、HBeAg的浓度分 别下降了65.3%、62.7%。荧光定量PCR法测定上清HBV-DNA含量:TR一L 组与TR组细胞上清中HBV-DNA的含量与对照组相比有明显下降 (P0.01),各对照组含量差异没有统计学意义(P.05):TR一L组与TR 组相比有差异(P0.05)。TR一L组与空感染组相比,浓度下降了59.9%。 各组细胞感染后观察形态与感染前无差别,M竹比色分析显示,各组间差 别无统计学意义,说明细胞增殖未受抑制。 以上结果表明,linke:的插入可能通过优化HBVc和hEDN分子之间的 空间构象降低其空间位阻而增强TR的抗HBV效率。尽管诸多实验条件如 细胞状态、细胞数量、细胞代数等不同,但从TR.L真核表达载体及TR.L 重
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R346

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【引证文献】
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【参考文献】
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【共引文献】
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中国博士学位论文全文数据库 前10条
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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
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【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前4条
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【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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