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《第四军医大学》 2004年
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低氧预刺激对大鼠骨髓源性内皮祖细胞生物学活性的影响

李毅  
【摘要】:研究背景及目的 内皮祖细胞(EPCs)是胚胎发育早期参与血管发生(Vasculogenesis)的最重要的干细胞,近年研究发现成人骨髓和外周血中也存在少量EPCs。由于EPCs具有活跃的分化增生能力和不依赖于血管内皮细胞(ECs)的成血管能力,因此可作为干细胞移植促血管新生治疗的一种理想的细胞供体,尤其对于老年、糖尿病、高脂血症等由于ECs功能受损而对细胞/生长因子反应低下的患者而言,其治疗价值更为突出。但EPCs移植是一种个体化治疗,细胞来源较少,即使通过体外培养扩增获得的数量亦有限,因此通过体外干预方法促进EPCs的生物学活 第四军医人学硕!:学位论文 性是提高其治疗效能的关键手段。既往研究表明低氧环境可诱导多种细胞 系VEGF和VEGF受体(VEGFR)表达上调,激活ECs的成血管功能, 促进局部血管生成,但低氧对于EPCs是否有类似的作用鲜有报道。本实 验旨在观察低氧条件对大鼠骨髓源性EPCs的增殖、移行、旁分泌及成血 管能力等生物学活性的影响,并探讨其可能的机制,为临床应用EPCs移 植前的低氧预刺激及其疗效评价提供理论依据。 实验方法(l)采取大鼠骨髓,以密度梯度离心分离单个核细胞 (MNCs),于体外培养并由牛垂体提取物(PEX)诱导扩增,经DII标记 的乙酞低密度脂蛋白(Dil一acLDL)和异硫氰酸盐荧光素标记的单叶豆凝 集素(FITC一BS一Leetin)双染阳性鉴定为EPCs。(2)低氧条件采用三气 培养箱,控制氧浓度在2%,持续培养7天,观察细胞生物学行为的变化。 (3)EPCs增殖活性采用细胞计数法测定细胞数量及其细胞倍增时间。(4) EPcs的迁移能力通过Unde卜Agarose模型诱导趋化,分别用显微镜测定 迁移细胞数和细胞平均迁移距离。(5)EPCs的旁分泌功能测定采用EPCs 条件培养液刺激ECs,并用BrdU法测定ECs核DNA复制。(6)EPCs 的成血管能力测定采用I型胶原凝胶系统,光镜下观察EPCs形成管腔样 结构的数目。(7)VEGF和Flk一1 mRNA表达测定采用半定量又卜PCR法。 (8)场触stem Bfot法测定丝裂原激活蛋白激酶ERKI/2介导低氧预刺激对 细胞增殖活性的影响。 实验结果(l)体外成功培养出EPCs,并经免疫荧光染色鉴定证 实形态及生物学特征符合内皮祖细胞。(2)低氧培养可增加EPCs增殖活 性,诱导细胞倍增时间明显前提,细胞数增加约1倍;(3)低氧预刺激 促使EPCs对VEGF的趋化、移行能力提高,移行细胞数和最大移行距离 均较对照明显增加;(4)低氧组EPCs条件培养液刺激HUVECs后,显 著加速细胞DNA复制,提示低氧预刺激可能促进EPCs的旁分泌功能; (5)采用I型胶原凝胶成血管模型测定低氧预刺激后EPCs体外成血管 能力增强,;(6)低氧预刺激后EPCs的VEGF及Flk一1 mRNA表达上调, 第四军医人学硕l学位论文 与增殖、移行等生物学活性指标的提高呈一致性;(7) Westemblot分析 低氧预刺激后磷酸化ERKI/2表达增强,与细胞增殖活性变化相一致,并 可被特异性阻断剂PD98059所抑制,提示MAPKs信号途径参与低氧预 刺激EPCs增殖机制的调控。 结论低氧预刺激可多方面改善EPCs生物学活性,包括增殖活性、 移行能力、旁分泌及体外成血管功能,其改变与vEGF及vEGFR表达的 增高呈一致性。丝裂原激活蛋白激酶ERKI/2参与低氧诱导EPC:增殖, 系调控细胞增殖信号转导途径的关键环节,但低氧刺激并非其唯一的作 用靶点。低氧预刺激可作为提高临床EPCs治疗效能的潜在手段,并需在 体实验进一步证实。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R329.2

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