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单核细胞趋化蛋白-1在增生性玻璃体视网膜病变中的作用研究

韩泉洪  
【摘要】:目的:增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)是有多种炎性因子、炎症细胞和组织细胞参与的损伤修复过程,巨噬细胞在PVR的发病过程中有重要的作用,单核细胞趋化蛋白—1(monocyte chemotactic protein-1,MCP—1)可以特异性地趋化巨噬细胞和淋巴细胞向炎症的部位聚集,而视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)是其中主要的增殖细胞。本实验研究的目的是(1)评价巨噬细胞调理液(MCM)对培养人RPE合成MCP-1的作用;(2)观察MCP—1对RPE移行的作用和地塞米松和道诺霉素对这种作用的影响,以及细胞信号转导通道阻滞剂对这个过程的作用;(3)观察视网膜脱离后不同时期的临床标本组织中MCP—1的表达与巨噬细胞和淋巴细胞的关系。 方法:(1)在培养人RPE的培养液中加入20%培养人巨噬细胞调理液(MCM)、白细胞介素—1β(IL—1β)或肿瘤坏死因子—α(TNF—α)(0.2,2,20ng/ml)培养2、4、8、16、24和48h后,对培养细胞爬片进行免疫组化和原位杂交染色,并对培养RPE的上清液作Western blot检测MCP—1的含量。同时在培养液中加入地塞米松(10~(-8),10~(-7),10~(-6)M)或道诺霉素(2μg,20μg,200μg/L)重复上述实验,观察在此条件下MCM对MCP—1合成的作用;(2)处于生长融合状态的单层RPE用剃须刀片刮出一片无细胞的区域,在无血清培养液中加入MCP—1、IL—1β和TNF—α,培养20h后计数进入刮痕区的细胞,观察这些因素对RPE移行的作用。同时另设实验组在培养液中分别加入MCP—1中和抗体、地塞米松、道诺霉素、蛋白激酶C抑制剂(Calphostin C,CC)和钙离子通道阻滞剂维拉帕米(Verapamil,Ver),观察这些条件下MCP—1对RPE移行作用的变化。最后用MTT法检测了MCP—1对RPE的促增殖作用;(3)选用视网膜手术取材标本,包括裂孔源性视网膜脱离视网膜下液中的细胞成份,B级PVR玻璃体手术集取物以及PVR C/D级的视网膜增殖膜,免疫组化法检测其中MCP—1、CD68和CD3的表达状态。 结果:(1)Western blot检测表明培养的人RPE在无药物作用的条件下,MCP—1的分泌为阴性,20%MCM、IL—1β和TNF—α培养条件下,2h时可以检测到分泌的MCP—1,而且随着时间和药物浓度的增加而上升,并在16h达到较高水平,但是MCM培养过程中MCP—1的分泌浓度较低,约为IL—1β条件下的1/5。原位杂交和免疫组化结果验证了Western blot的结果。加入地塞米松


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