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《第四军医大学》 2007年
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低强度脉冲电磁场对体外培养大鼠骨髓间充质干细胞的影响

周娅蕾  
【摘要】: 20世纪70年代以来,脉冲电磁场(pulsed electromagnetic fields,PEMFs)作为一种非侵入性治疗方法被用于骨折延迟愈合、骨不连、骨质疏松症等骨科疾病。电磁场能促进活细胞增殖及分化,刺激骨局部因子的产生,并能改善股骨的骨密度和生物力学特性。但是电磁场对骨的作用机理还不是很清楚,电磁场的频率、场强、作用时间以及脉宽波形等对治疗效果也有不同程度的影响。间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是存在于骨髓基质系统中的一种组织干细胞,具有自我更新能力和多向分化潜能,一定的诱导条件下可分化为成骨细胞。而且成体干细胞具有注入体内后的趋化性特征,较明显的集中到受损部位,到达受损伤部位后,在局部微环境的诱导下,成体干细胞发生明显的诱导分化,使成体干细胞向损伤组织修复所急需的组织细胞分化,从而促进损伤组织的修复[1]。这对骨科疾病的自体细胞治疗甚至异体细胞的治疗提供了可能性。 本课题主要研究低强度PEMFs对体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(rat mesenchymal stem cells, rMSCs)增殖及向成骨细胞分化的影响。应用MTT法、ALP测定、四环素荧光标记、钙结节染色法测定MSCs增殖及向成骨细胞分化后的体外骨形成情况。初步探讨了频率和强度对rMSCs增殖和成骨分化的影响。为临床应用PEMFs治疗骨折、骨不连、骨质疏松症等骨科疾病提供了新的思路与方法。 主要工作概括如下: 1、rMSCs的原代培养 目的:探讨rMSCs简单有效的体外原代培养方法。方法:用全骨髓贴壁法分离rMSCs,差速黏附法进行纯化,绘制原代及生长良好的第3代细胞的生长曲线,进行PAS-过碘酸雪夫氏染色、油红-O染色和碱性磷酸酶(ALP)染色。结果:细胞形态良好,具有MSCs外观,生长曲线呈典型的S型,染色结果均为阴性,提示细胞未分泌肝糖元,未向脂肪细胞及成骨细胞方向分化。结论:实验采用的方法可以获得一定量的rMSCs,方法简单可行,为进一步实验提供了物质基础。 2、PEMFs对rMSCs增殖的影响 目的:探讨不同频率,不同磁场强度的PEMFs对rMSCs的影响。方法:用全骨髓贴壁法分离rMSCs,对生长良好的第3代细胞进行15Hz ,0.2mT; 15Hz ,0.4mT;15Hz ,0.8mT;1Hz,0.2mT; 1Hz,0.4mT; 1Hz,0.8mT的PEMFs刺激,MTT法测定细胞增殖水平,流式细胞仪法测定细胞周期变化。结果:rMSCs经PEMFs刺激5d(1次/1d,每次3h)后,各实验组细胞增殖水平和(S+G2/M)期细胞数量均有不同程度提高,差异有统计学意义(P0.05)。其中MTT水平以1Hz,0.4mT组变化最为明显(3d,0.323±0.051;5d,0.714±0.058),和对照组相比(3d,0.246±0.044;5d,0.487±0.064),差异具统计学意义(P0.01);细胞周期变化也以1Hz,0.4mT组变化最为明显(G0/G1:75.3±0.17,S:8.5±0.12,G2/M:16.4±0.20,PI:24.9),相对于对照组(G0/G1:83.3±0.33,S:7.0±0.29,G2/M:9.8±0.23,PI:16.8),差异具有统计学意义(P0.05)。结论:rMSCs经PEMFs场刺激后,能促进体外培养该细胞的增殖水平,磁场参数对实验结果有影响,以1Hz,0.4mT的PEMFs效果最佳。 3、PEMFs对rMSCs成骨分化的影响 目的:探讨PEMFs刺激对rMSCs向成骨细胞分化的影响。方法:用全骨髓贴壁法分离rMSCs,经差速黏附法筛选,对生长良好的第3代细胞进行频率1Hz、磁感应强度0.4mT的PEMFs刺激,检测碱性磷酸酶活性,进行四环素荧光染色和钙结节染色。结果:rMSCs经PEMFs刺激(1次/1d,每次3h)后,实验组碱性磷酸酶水平升高,差异有统计学意义(P0.05),四环素荧光染色和钙结节染色结果均呈阳性。结论:推测PEMFs能影响rMSCs向成骨细胞的分化。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:Q813

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