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《第四军医大学》 2007年
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兔抗人CIDE-3蛋白多克隆抗体的制备及应用

姚丽  
【摘要】: 细胞凋亡是一种由多种基因共同调控的自身编码的死亡方式,确保了正常的胚胎发育和机体内环境的自身稳定。在形态学上,DNA的片段化为细胞凋亡的特征性表现。DFF40(DNA fragmentation factor 40)是一种DNA酶,在DNA片段化过程中发挥着关键性的作用。CIDE(cell death-inducing DFF45-like effector)家族蛋白同DFF蛋白在多肽链的N端具有同源性,是细胞凋亡诱导因子中的一个新成员,现在已知的CIDE蛋白中,人类有CIDE-A、CIDE-B和CIDE-3。其中人CIDE-3基因于2003年发现,其在GenBank中的登录号为AC007783,位于人类3p25染色体上,全长约169 kb,人CIDE-3基因cDNA含有1305个碱基,存在选择性剪切,具有诱导细胞凋亡的功能。但是,人CIDE-3基因在组织中的分布、其生理和病理功能以及与细胞凋亡的关系目前还不清楚。 为此本研究通过RT-PCR方法获得人CIDE-3的编码区基因,构建原核表达载体,经测序和酶切鉴定后,转化大肠杆菌进行体外表达,获得了人CIDE-3原核表达蛋白。免疫新西兰大白兔,制备出多克隆抗体,经鉴定后,应用免疫组织化学法初步了解了人CIDE-3蛋白在人类部分正常组织和部分肿瘤组织中的分布。 本文研究结果: 1.构建了原核表达载体pET28a(+)-CIDE-3。经酶切鉴定和DNA测序,目的基因片段的序列同GenBank中登录的相应序列完全吻合。 2.在大肠杆菌中表达了人CIDE-3蛋白N端的172个氨基酸,由Ni-NTA Agarose (pH 8.0)纯化。SDS-PAGE和Western blot证实获得了纯化的人CIDE-3蛋白。 3.制备兔抗人CIDE-3蛋白多克隆抗体,ELISA结果显示,该多克隆抗体效价高于1:30000,具有较高的亲和性;Western blot结果显示,该多克隆抗体可以与人CIDE-3蛋白特异性结合。免疫组织化学染色,结果显示人CIDE-3蛋白分布于部分胃粘膜上皮细胞的细胞质中,属于细胞质蛋白;通过比较胃组织连续切片的免疫组织化学染色片和HE染色片推测阳性细胞可能为胃粘膜壁细胞。 4.人CIDE-3蛋白阳性表达于肾脏肾小管上皮细胞(5/5例)(肾皮质2例、肾髓质3例阳性染色);食道粘膜鳞状上皮细胞(5/5例)、心肌(4/5例)、结肠粘膜上皮细胞(7/10例)、胰腺(3/5例)(胰岛1例、胰腺外分泌腺体2例阳性染色)和肝(2/5例)。阳性物质均位于细胞胞质中,呈棕黄色颗粒状。脑(0/5例)和肺组织(0/5例)未见阳性细胞。 5.人CIDE-3蛋白还存在于原发性肝细胞癌(hepatic cell carcinoma,HCC)(10/37例)、胃腺癌(4/19例)和乳腺癌(1/17例),HCC细胞中人CIDE-3蛋白的阳性表达率(10/37例)显著低于癌旁肝细胞(28/29例)(P0.05),其中各分化阶段HCC细胞(高、中、低分化)中人CIDE-3蛋白的阳性表达率分别低于癌旁肝细胞(P0.05)。 综上所述,本研究构建了人CIDE-3基因的原核表达载体,体外表达并纯化了人CIDE-3蛋白,制备了多克隆抗体。并初步了解了人CIDE-3蛋白在人部分正常组织和部分肿瘤组织中的表达情况,为今后研究人CIDE-3基因和蛋白的功能奠定了基础,为肿瘤的诊断、预防和治疗提供了新的思路。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R392

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