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《第四军医大学》 2004年
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针对HER2的RNA干涉对人乳腺癌细胞生长的影响

鲍炜  
【摘要】: RNA干涉(RNA interference,RNAi)是一种广泛存在于高等植物和动物中的由双链RNA介导的转录后基因沉寂(PTGS)现象。外源的双链RNA(dsRNA)在细胞内一种被称为Dicer的核酸酶的作用下,首先被剪切成含19-23个核苷酸对的小RNA片段,称为小干涉RNA(small interfering RNA ,siRNA)。后者与Dicer和其他一些蛋白质共同构成RNA诱导的沉寂复合物(RISC),依靠碱基互补规律识别与siRNA同源的mRNA分子,并将它们降解。目前RNAi作为一种高效特异地抑制基因表达的新技术,已广泛应用于基因功能和基因治疗等研究中。在肿瘤基因治疗中,通过人工合成特定癌基因靶向的siRNA,或构建上述siRNA的表达载体,并将它们导入肿瘤细胞中,可以特异性地抑制目的基因的表达。 HER2/neu是表皮生长因子受体家族的第二位成员,表皮生长因子受体(EGFR)家族,也称为HER或ErbB2家族,在细胞信号转导中发挥重要作用,是细胞生长、分化及存活的重要调节者。此家族包括EGFR(HER1或ErbB1)、HER2/neu(neu或ErbB2)、HER3(ErbB3)及HER4(tyro2或ErbB4)。人HER2/neu基因定位于17号染色体长臂,表达产物为分子量185kDa的单链跨膜糖蛋白,即p185。p185含有1255个氨基酸残基,细胞内段(ICD)具有酪氨酸蛋白激酶活性。HER2/neu通过多种细胞内分子参与信号转导,其主要下游物质包括丝裂原活化蛋白(MAP)激酶、PI3激酶、C-src、Shc及Grb2等。已知有9种配体能直接与EGFR、HER3或HER4结合,它们是表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGFα)、肝素结合EGF样生长因子(HB-EGF)、双调蛋白(amphiregulin,AR)、BTC(beta-cellaulin)、EPR(epiregulin)、HRG(heregulin)、NRG-2(neuregulin-2)、NRG-3(neuregulin-3)。到目前为止尚未发现能与HER2/neu直接结合的配体,但其通过与家族中其他三位成员构成异源二聚体,HER2/neu间接与配体连接。在组织中EGFR家族成员很少以单独形式存在,而是形成不同组合,构成同源或异源二聚体,放大信号转导而发挥生物学作用。由HER2/neu组成的受体复合物比其他受体联合更有效,因为HER2受体复合物具有较高的配体结合能力,且内化率低,能在浆膜上停留更长时间,延长受体信号转导的持续时间,HER2是一种非常活跃的酪氨酸蛋白激酶,其自身突变及过度表达可使其自身活化。 以往研究表明,HER2分子与肿瘤细胞的生长有关,本研究据此构建了针对癌基因ErbB2/HER2/neu的siRNA表达载体,分别命名为pSUPER-sihe1和pSUPER-sihe2,研究它们对人乳腺癌SKBr3细胞中HER2表达的抑制作用,以及HER2被抑制后对细胞生长增殖的影响。 用pSUPER-sihe1、pSUPER-sihe2、pSUPER空载体瞬时转染SKBr3细胞,在第二天就可观察到实验组细胞形态的改变,并出现死亡的细胞,随着时间的推移,实验组细胞死亡数目增加,而对照组细胞生长良好;对细胞爬片进行瞬时转染,免疫荧光染色,发现随着转染天数的增加,实验组细胞开始死亡,并出现多核现象;通过电镜可以观察到有凋亡发生。 为了检测RNA干涉的效果,我们对SKBr3细胞进行稳定转染,用G418对实验组细胞进行筛选,三周后获得阳性克隆,通过筛选所得的建系细胞生长明显缓慢,利用RT-PCR在RNA水平进行检测,发现两实验组的RNA水平表达明显降低,说明设计的两组siRNA都能发挥抑制作用,我们还检测了细胞表面HER2分子的蛋白表达水平,观察到对照组细胞高水平表达HER2,这与以往研究结果一致;而实验组的HER2表达明显减弱,证实siRNA成功的抑制了HER2蛋白的表达。 实验结果表明,RNA干涉有效的抑制了HER2分子的表达,并进而影响SKBr3细胞的生长,为进一步研究HER2分子与肿瘤细胞生长的关系奠定了基础。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R737.9

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