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天然多酚类化合物的肠道转运与代谢研究

滕增辉  
【摘要】: 目的天然多酚类化合物广泛存在于自然界中,是一类含有氧杂环的有机化合物,多存在于高等植物中,富含于人类日常生活密切相关的食物、蔬菜及水果中,具有多种生理活性,如抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗感染、抗肿瘤及抗骨质疏松作用,有的还具有类雌激素样作用。天然多酚类化合物对于维持机体内稳态以及对某些疾病的预防和治疗作用受到了世人的关注,是天然药物中重要的活性组成部分,以多酚类药物结构为母核的药物研究及保健品开发方兴未艾。但大部分多酚类化合物口服后生物利用度不高,在肠道的吸收机制仍不明确。本研究从药物代谢动力学的角度出发,通过整体动物试验,结合肠道原位灌流模型以及Caco-2细胞模型,研究多酚类化合物在肠道的吸收特点和规律,并从细胞水平分析它们的吸收、代谢及转运机制,为多酚类化合物的结构改造提供依据,为天然多酚类药物/保健品的合理应用提供理论指导。 方法(1)采用0.5% CMC-Na将选定的多酚类化合物(芹菜素、大黄酚、大黄素、白藜芦醇)制成50 =mol/kg的混悬液,大鼠灌胃给药后0.08、0.17、0.5、1、2、4、8、12、16、24、36h用乙醚麻醉大鼠,腹静脉采集血样(肝素抗凝),3000rpm离心10min,分离血浆。通过高效液相色谱-质谱连用(LC/MS/MS)方法,采用电喷雾电离负离子模式( ESI- ),多反应监测(MRM)方式检测灌胃给药后,大鼠血浆中多酚类药物浓度随时间变化的规律,同时通过一级全扫描质谱分析和二级质谱分析(子离子扫描),鉴定血浆中多酚类化合物的代谢产物,并通过?-葡萄糖醛酸酶和硫酸酯酶水解的方法,定量分析原形药物、葡萄糖醛酸化和硫酸酯化代谢产物的浓度。Cmax采用实测值,采用梯形法计算AUC值,结合药代动力学软件3P97对所得血药浓度-时间数据进行处理,计算并分析多酚类化合物在大鼠体内代谢的动力学参数。(2)腹腔注射4%的苯巴比妥钠(40mg/kg)麻醉大鼠,尾静脉注射肝素(90 U/ kg)全身抗凝,选取7-11厘米长的肠段,于近端和远端插管,并分别在肠系膜静脉和肠系膜上动脉插管,建立大鼠原位小肠灌流模型,通过肠道灌流50=mol/kg的芹菜素、大黄素、大黄酚,于灌流后10、20、30、40、50、60 min,分别收集肠道和肠系膜静脉的流出液。采用一级全扫描质谱分析和二级质谱分析(子离子扫描),鉴定肠道和血管流出液中多酚类化合物的代谢产物。用?-葡萄糖醛酸酶和硫酸酯酶处理样品,采用高效液相色谱-质谱连用的方法,定量分析原形药物、葡萄糖醛酸化和硫酸酯化代谢产物浓度的变化规律。(3)24孔板培养Caco-2细胞,密度为5×10~4个/孔,至14-20天时,用于测定多酚类药物在Caco-2细胞中的摄取特点。实验前换无血清培养液37℃培养24h,用HBSS液平衡15分钟,将待测的多酚类药物按设定浓度和Caco-2细胞孵育一定的时间(5、10、30、60、120 min),同时选择不同的转运载体抑制剂,考察细胞摄取药物浓度与载体之间的关系。液氮反复冻融、高速离心裂解细胞,乙酸乙酯提取细胞裂解液中的药物,通过高效液相色谱法和?-葡萄糖醛酸酶、硫酸酯酶水解的方法,定量分析原形药物、葡萄糖醛酸化和硫酸酯化代谢产物的浓度,并通过考马斯亮蓝法测定细胞中蛋白含量。接种Caco-2细胞于Millicell培养皿上,密度为1×10~5个/孔,细胞培养至19-21天时,Millicell-ERS电压电阻仪测定Millicell培养皿两侧的电阻值(TEER),评价Caco-2细胞单层膜的完整性,当TEER值B300·cm~2时,可用于测定多酚类药物在Caco-2细胞中的转运特点。实验前换无血清培养液37℃培养24h,用HBSS液平衡15分钟,分别从顶侧及基底侧加入1.5mL和2.0mL一定浓度的多酚类药物,按照设定的时间点(10、20、30、40、50、60 min)分别从顶侧及基底侧取样,加入200μL内标溶液,混匀,高速离心,用?-葡萄糖醛酸酶和硫酸酯酶处理样品,通过高效液相色谱法定量分析原形药物、葡萄糖醛酸化和硫酸酯化代谢产物浓度的规律。 结果(1)大鼠灌胃给予芹菜素、大黄酚、大黄素和白藜芦醇后,药物可被迅速吸收进入血液循环,芹菜素、大黄素和白藜芦醇的吸收速度均比较快,血药浓度时间-曲线呈明显的双峰现象。芹菜素的峰值血药浓度为45±2ng/mL,达峰时间为0.5小时,给药后2小时出现第二个吸收高峰,峰值为34±1ng/mL。大黄素在给药0.5小时后达到吸收高峰,血药浓度为72±6ng/mL,与芹菜素相比,其第二个吸收高峰出现的较晚,大约在给药后8小时出现第二个吸收峰,其血药浓度峰值为49±6ng/mL。白藜芦醇吸收迅速,在给药0.2小时就出现第一个吸收高峰,峰值血药浓度为94±5ng/mL,给药后8小时出现第二个吸收高峰,血药浓度为18±2ng/mL。与前三者相比,大黄酚的吸收量较多,但吸收速度相对比较缓慢,2小时达到高峰,血药浓度为326±14ng/mL,未观察到双峰现象。大鼠灌胃给予50 =mol/kg芹菜素、大黄酚、大黄素、白藜芦醇,其AUC分别为659、1721、809、98 (ng/ml)*h,T1/2Ke分别为2.112、8、2.931、1.823 h。对血浆样品提取物进行一级全扫描质谱分析,可检测到特定的准分子离子峰(m/z 349.7和m/z 446,m/z 333.7和m/z 429.3,349.7和m/z 446,m/z 306.9和m/z 402.7),分别比原形药物(芹菜素、大黄酚、大黄素和白藜芦醇)的准分子离子峰多80 u和176u,选择性对这些离子峰进行二级质谱分析(子离子扫描),发现它们均能脱去176 u和80u的碎片,正好对应于代谢产物中的葡萄糖醛酸和硫酸酯部分。分别用?-葡萄糖醛酸酶和硫酸酯酶处理样品,经MRM方式检测,发现芹菜素(m/z268.9H116.8)、大黄酚(m/z 253.3H225.2)、大黄素(m/z 269.4HI225.4)和白藜芦醇(m/z 226.9H142.8)的色谱峰面积均高于未加酶组样品的峰面积,提示上述药物代谢过程中均有葡萄糖醛酸化和硫酸酯化代谢产物的生成。在大鼠体内葡萄糖醛酸化芹菜素的量相对较多,在给药后1小时出现代谢高峰,葡萄糖醛酸化芹菜素的峰浓度为51±3 ng/mL。而硫酸酯化芹菜素量较少,其在给药后0.5 - 4小时之间量较高。体内葡萄糖醛酸化大黄酚的量在8小时出现高峰,峰浓度为82±9 ng/mL,占血中药物(大黄酚+葡萄糖醛酸化大黄酚+硫酸酯化大黄酚)总量的51.7%,而硫酸酯化大黄酚仅占血中药物(大黄酚+葡萄糖醛酸化大黄酚+硫酸酯化大黄酚)总量的2.5%。葡萄糖醛酸化大黄素在给药后1 -12小时之间生成的量较多,硫酸酯化大黄素在给药后0.5小时出现高峰,占血中药物(大黄素+葡萄糖醛酸化大黄素+硫酸酯化大黄素)总量的15.22 %。葡萄糖醛酸化白藜芦醇在0.5小时出现高峰,浓度为113±9ng/mL,占血中药物(白藜芦醇+葡萄糖醛酸化白藜芦醇+硫酸酯化白藜芦醇)总量的42.54 %,而硫酸酯化的白藜芦醇占血中药物(白藜芦醇+葡萄糖醛酸化白藜芦醇+硫酸酯化白藜芦醇)总量的17.9%。(2)对灌流液提取物进行一级全扫描质谱分析,可检测到特定的准分子离子峰,分别比原形药物(芹菜素、大黄酚和大黄素)的准分子离子峰多80 u和176u。选择性对这些准分子离子峰进行二级质谱分析(子离子扫描),发现它们均能脱去176 u和80u的碎片,正好对应于代谢产物中的葡萄糖醛酸和硫酸酯部分。分别用?-葡萄糖醛酸酶和硫酸酯酶处理样品,经MRM方式检测,发现芹菜素、大黄酚和大黄素的色谱峰面积均高于未加酶组样品的峰面积,提示葡萄糖醛酸化和硫酸酯化的代谢产物分别经?-葡萄糖醛酸酶和硫酸酯酶水解后释放出原形的药物。实验结果发现,大约28.88%的芹菜素出现在血管的一侧,其中原形药物占16.39%,葡萄糖醛酸化芹菜素和硫酸酯化芹菜素分别占8.7%和3.79%,肠道流出灌流液中存在葡萄糖醛酸化芹菜素和硫酸酯化芹菜素,分别为灌流药物总量的12.93%和1.83%。约48.56%的大黄酚出现在血管的一侧,其中原形药物占32.22%,葡萄糖醛酸化大黄酚和硫酸酯化大黄酚分别占13.85%和2.48 %。肠道流出灌流液中存在葡萄糖醛酸化大黄酚和硫酸酯化大黄酚,分别为灌流药物总量的8.63%和4.34%。大约22.55%的大黄素出现在血管的一侧,其中原形药物占12.01%,葡萄糖醛酸化大黄素和硫酸酯化大黄素分别为8.69%和1.84%。肠道流出灌流液中存在葡萄糖醛酸化大黄酚和硫酸酯化大黄酚,分别为灌流药物总量的5.23%和1.04%。芹菜素、大黄酚、大黄素和它们代谢产物的总回收率分别为98.09±3.5%,99.53±4.3%,和96.49±2.2%。与芹菜素和大黄素相比,大黄酚的吸收量较多,48.56%的灌流药物以大黄酚、葡萄糖醛酸化大黄酚和硫酸酯化大黄酚三种形式转运到血管侧,而芹菜素和大黄素转运到血管侧的比例较少,分别为28.88%和22.55%;但是,芹菜素和大黄素进入血管侧的代谢产物较多,分别为43.23%和46.72%,而大黄酚进入血管侧的代谢产物所占比例相对较少,为33.53%,大部分以原形的形式入血。(3)芹菜素、大黄酚、大黄素和白藜芦醇均可被Caco-2细胞迅速摄取,大黄酚和大黄素的最大摄取浓度为414±15nmol/L·mg·protein和108±12nmol/L·mg·protein。多酚类化合物在Caco-2细胞中的摄取随着药物浓度的增加呈现一定的差别,芹菜素和大黄素的饱和浓度为50 =M,白藜芦醇的饱和浓度为100 =M,而大黄酚在Caco-2细胞中的摄取量随着药物浓度的加大而增长,200 =M时仍未达到饱和。药物与Caco-2细胞孵育1小时后,细胞中大黄素和白藜芦醇代谢产物的量均超过了药物总量(原形药物+葡萄糖醛酸化+硫酸酯化代谢产物的总量)的50%,其中葡萄糖醛酸化和硫酸酯化白藜芦醇分别占26.56%和25.16%,而大黄素的这两种代谢产物所占的比例分别为45.16%和10.75%。芹菜素和大黄酚在细胞中代谢产物的量稍低于前两者,其中葡萄糖醛酸化芹菜素和硫酸酯化芹菜素分别为17.82%和13.27%,而大黄酚的这两种代谢产物所占的比例分别为33.45%和6.7%。根皮苷可以抑制Caco-2细胞对大黄酚和大黄素的摄取,细胞中药物的浓度分别下降了41%和34%,而对芹菜素和白藜芦醇的摄取没有明显影响。P糖蛋白抑制剂维拉帕米、MRP2抑制剂环苞菌素A能够增加多酚类化合物在Caco-2细胞中的摄取量。 结论(1)芹菜素、大黄酚、大黄素和白藜芦醇在大鼠体内均可被迅速吸收进入血液循环。(2)芹菜素、大黄酚、大黄素和白藜芦醇在大鼠体内均易发生葡萄糖醛酸化代谢,而硫酸酯化代谢与多酚类化合物的母核结构及羟基的位置有关。(3)芹菜素、白藜芦醇、大黄酚和大黄素在肠道II相代谢酶的作用下,易生成葡萄糖醛酸化和硫酸酯化代谢产物,一部分代谢产物被吸收入血,同时一定比例的代谢产物被外排至肠腔侧。提示多酚类化合物在肠道发生了广泛的“首过代谢”是其口服生物利用度低的原因之一。(4)Caco-2细胞中大黄素和大黄酚葡萄糖醛酸化的代谢产物远多于硫酸酯化的代谢产物,提示与硫酸转移酶相比,大黄素和大黄酚与肠道UDP-葡萄糖醛酸转移酶的亲和力更高,容易生成葡萄糖醛酸化代谢产物。Caco-2细胞中芹菜素、白藜芦醇的葡萄糖醛酸化代谢产物与硫酸酯化代谢产物的量之间差别不大,提示芹菜素和白藜芦醇对硫酸转移酶亦具有较高的亲和力。(5)根皮苷能够抑制大黄酚和大黄素在Caco-2细胞中的摄取,提示SGLT1可能是Caco-2细胞摄取大黄素和大黄酚的途径之一。(6)环孢菌素A能够增加Caco-2细胞对芹菜素、白藜芦醇、大黄酚和大黄素的摄取,提示Caco-2细胞上的MRP2可能在这几种化合物的跨膜转运过程起着重要的调控作用,MRP2抑制剂或诱导剂可与芹菜素、白藜芦醇、大黄酚和大黄素在胃肠道发生药代动力学相互作用,影响这几种化合物的药效和毒性。(7)多酚类化合物结构中的酚羟基可能是这类化合物在肠道发生首过消除以及生物利用低的结构基础。多酚类化合物的母核结构以及羟基的数目和位置影响他们与Ⅱ相代谢酶以及p-GP、MRP2等药物转运载体的亲和力,从而生成不同类型的Ⅱ相代谢产物,在胃肠道体现不同的吸收特性,最终影响这类化合物的药理效应。


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