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《第四军医大学》 2007年
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肌细胞增强因子-2与中国北方汉族人群冠心病的相关性研究

杨勇  
【摘要】: 研究背景及研究目的 心血管疾病是当今世界威胁人类健康最严重的疾病之一,其发病率和死亡率均超过肿瘤性疾病而跃居第一。其主要的表现形式包括冠心病(CHD)、心肌梗死(MI)、充血性心力衰竭、先天性心脏病等。目前认为,心血管疾病的发生与各种环境因素(诸如性别、年龄、血压、血脂和糖尿病)和遗传因素密切相关。虽然对于心血管疾病发生的病理学机制还不十分清楚,但是流行病学调查和双胞胎遗传背景的研究都已经充分肯定了遗传学因素在心血管疾病中的关键作用。通过对MONICA监测区域冠心病发生的流行病学调查结果分析,我国北方地区冠心病发病率和死亡率位居全国首位。因此,对中国北方汉族人群冠心病易感基因的研究对这一疾病的防治策略将具有重要意义。 早期的研究工作主要集中在冠心病高危风险因素相关基因的研究上,如血脂代谢、凝血和纤溶系统、血小板膜受体基因等。但迄今为止,这方面研究中仍未发现与冠心病发生直接相关的致病基因。近年来,人类基因组图谱的绘制完成和单核苷酸多态性(SNP)第三代遗传学标记的出现,使得通过全基因组水平进行遗传连锁分析,定位多基因遗传性疾病易感基因的研究工作成为可能。近年来,在冠心病易感基因研究领域中也取得了一些令人瞩目的突破性进展。2000年以后,在芬兰人、印度人、墨西哥裔美国人中,几个大规模冠心病遗传易感基因的全基因组扫描工作被先后完成。综合分析这些研究结果发现,某些易感位点上的定位结果具有一致性,主要集中在第1、3、6、9、14号等染色体片段,但具体的易感基因位点尚未最终确定。2003年,王擎博士在美国白人冠心病遗传家系中发现冠心病的致病基因是肌细胞增强因子-2基因(Myocyte Enhancer Factor-2, MEF2A),其在冠心病患者中的突变方式是第11外显子的21个碱基的缺失突变。细胞功能实验研究显示,这种缺失突变通过负显性效应机制影响转录因子MEF2A基因在细胞核中的定位,同时降低MEF2A的转录水平及蛋白质合成。随后此研究组在冠心病的散发人群MEF2A基因第7外显子上又发现了3种致病的点突变(N263S,P279L,G283D),以上研究进一步证实了MEF2A基因是冠心病的致病基因。 人们最初发现MEF2A是一种富含AT序列的特异性肌细胞转录因子,调控多种骨骼肌和心肌细胞特异性基因的表达和转录。MFE2超家族包含4种同源蛋白,MEF2A、MEF2B、MEF2C、MEF2D。MEF2A基因定位于染色体15q26,由499个氨基酸组成,属于MADS框转录家族,N端的保守序列具有MADS结构域和MEF2A结构域,能够与其他转录因子结合形成二聚体并具有DNA结合活性;C末端的磷酸化位点是多种激酶的靶点,与启动基因表达有关,是MEF2A因子活性调节及发挥功能的主要区域。MEF2A基因位于多种肌细胞和内皮细胞特异性基因信号转导通路的下游,能够激活多种结构蛋白。MEF2A基因敲除小鼠出生后表现出右心室扩张,肌细胞线粒体排列紊乱,并有发生猝死的可能。而MEF2C缺陷小鼠则难以形成正常的心脏及脉管系统。因此,MEF2在调节血管平滑肌细胞增殖、内皮细胞发育和维持血管结构完整性中发挥着重要作用。 由于MEF2A与心血管系统疾病的关系仍然是目前争论的焦点,为了明确MEF2A基因与中国北方汉族人群冠心病发生的相关关系,我们进行了此项病例对照研究。 研究对象和研究方法 1.研究对象 从2003年11月至2006年5月,共入选726例在沈阳军区总医院心内科行冠状动脉造影的病人作为研究对象。其中男性492例,女性234例,平均年龄57.2±10.5岁。所有研究对象均签署知情同意书。本实验由医院道德伦理委员会批准实施。 2. PCR扩增 饱和酚-氯仿法提取基因组DNA,PCR方法扩增目的片段。PCR引物设计由Primer 5.0软件包完成。PCR扩增目的片段覆盖第7和第11外显子中有争议的突变位点。 3.第7外显子突变位点筛选 使用PCR-SSCP方法,根据预实验结果确定PCR扩增的效率、特异性以及变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离单链构象多态的灵敏度。对于实验结果中出现的异常片段,需要重复两次,然后纯化回收测序,并最终证实突变的位置和具体形式。 4.第11外显子(CAG)n等位基因的基因型分析 根据预实验中电泳及测序结果,将具有(CAG)的11次重复序列作为标准序列,其PCR产物作为内参,与待检测样品的MEF2A第11外显子PCR产物在15 %中性聚丙烯酰胺凝胶中,室温下电泳5 h,300伏电压,银染显色。将具有特殊电泳图形的PCR产物纯化回收,送测序鉴定。 5.统计学分析 应用四格表卡方检验方法计算病例组和对照组等位基因的分布频率,用卡方检验方法计算Hardy-Weinberg平衡分布。Logistic回归计算各种独立危险因素对冠心病发病的预测价值,同时计算相对危险度和95 %可信区间。Jonckheere-Terpstra趋势检验方法判断(CAG)_n等位基因与病变血管程度之间的相关关系。所有统计计算由SPSS13.0软件包完成。 结果 1.入选研究对象基线特征 在所入选的726例中,冠心病组378人,无冠心病348人。比较两组病人的临床基线特征,冠心病组在各种常见危险因素(诸如吸烟、高血压和糖尿病等)方面均明显高于对照组。 2.第7外显子基因突变的研究 所有726例入选研究对象MEF2A基因第7外显子PCR扩增片段,经PCR-SSCP检测后,未发现致病突变。 3.第11外显子(CAG)_n等位基因的基因型分析 (CAG)_n各种等位基因的基因型在人群中的整体分布符合Hardy-Weinberg平衡定律;对冠心病组和对照组各种等位基因基因型的分析发现,(CAG)_n=11等位基因在对照组的分布频率明显高于冠心病组(p=0.001);而(CAG)n=9等位基因在冠心病组的分布频率明显高于对照组,两者相比存在显著性差异(p=0.000, OR=1.958, 95 %CI=1.412-2.714)。这一结果表明,(CAG)n=9等位基因与冠心病的发生存在相关关系。为了进一步判断(CAG)_n=9等位基因对冠心病的预测价值同时排除由于基线不匹配对实验结果造成的影响,应用Logistic回归分析方法,将(CAG)_n=9等位基因与冠心病常见危险因素进行了综合比较,发现(CAG)_n=9等位基因是冠心病发生的独立危险因素(p=0.001, odds ratio=1.245, 95 %CI=1.095-1.417)。 根据冠状动脉造影结果,分析(CAG)_n等位基因与冠状动脉严重程度之间的相关关系,发现(CAG)_n=9等位基因在对照组中的分布频率最低(23.7 %),随病变血管支数的增加,(CAG)n=9等位基因在各组中的分布频率呈递增趋势,在三支血管病变患者中所占比例最高(39.7 %),Jonckheere-Terpstra趋势检验结果显示,(CAG)_n=9等位基因与冠状动脉病变血管支数之间存在相关关系。结论 MEF2A基因第11外显子(CAG)_n短串重复序列多态性和冠心病之间存在相关关系;(CAG)_n=9等位基因是冠心病发生的一种独立危险因素,其对冠心病的发生具有预测价值。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R541.4

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