脂肪成体干细胞定向诱导分化为软骨细胞的实验研究

【摘要】： 关节软骨的损伤和缺损是骨科常见的问题之一。关节软骨再生及自我修复能力极为有限,而传统的治疗方法如磨削术、钻孔微骨折术等均存在一定的缺陷,远期疗效不甚理想。近年来组织工程技术的发展为解决这一难题带来了新的希望,有望成为治疗软骨损伤的新方法。软骨组织工程就是将种子细胞接种到合适的生物支架材料上,在体外诱导后或者直接植入体内修复软骨缺损。因此,种子细胞及生物支架材料在组织工程软骨的构建中有着举足轻重的地位。 目的:从兔脂肪组织中分离出脂肪成体干细胞(ADASCs),体外经原代及传代培养后,在转化生长因子-β1(TGF-β1)存在的条件下,对比观察不同浓度的血清对ADASCs向软骨细胞增殖和分化的影响,探索较为合适的血清浓度;再将稳定传代后的ADASCs种植于纤维蛋白胶/透明质酸(FG/HA)复合支架上,在含TGF-β1的软骨诱导液中诱导培养,体外构建ADASCs、纤维蛋白胶/透明质酸及转化生长因子的组织工程软骨模块,探讨FG/HA作为软骨组织工程支架材料的可行性。 方法:1、ADASCs在不同的血清浓度下向软骨细胞分化:取成年新西兰兔颈部脂肪组织,剪碎后通过I型胶原酶消化,得到脂肪成体干细胞;稳定传代后,分别用含1%、10% FBS的软骨诱导液干预ADASCs 2周,采用MTT检测方法对细胞增殖活性进行比较,应用甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色进行软骨细胞鉴定,利用Leica病理图像软件分析两组间Ⅱ型胶原免疫组化染色后的灰度,比较两组细胞分化的效果。 2、TGF-β1诱导ADASCs体外构建改良纤维蛋白胶软骨模块:取传3代的ADASCs,消化、离心后,弃上清液,实验组(FG/HA组)加入100μL纤维蛋白胶(FG)催化剂液,将细胞与之混匀,再分别加入200μL透明质酸(HA)及100μL FG主体胶液,充分混匀,待其在室温下成凝胶状后移入24孔培养板中,加入诱导液培养。对照组(FG组)中不加HA,只加入200μL FG催化剂液和200μL主体胶液,其它操作同实验组。倒置显微镜逐日观察两组细胞生长情况以及支架降解情况;第14 d取出标本,2.5%戊二醛固定,扫描电镜下分别观察FG组及FG/HA组细胞与支架材料复合情况;10%中性甲醛溶液固定其余标本,石蜡包埋,切片,行HE染色、甲苯胺蓝染色,免疫组化法检测Ⅱ型胶原的表达。 结果:MTT检测显示10%FBS组细胞增殖活性高于1%FBS组(P0.05),两组细胞的甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色均为阳性,并以10%FBS组更为显著;灰度分析提示10%FBS组Ⅱ型胶原表达量高于1%FBS组(P0.05)。脂肪成体干细胞在支架内呈多层的三维生长,形态为圆形,增殖活性高。诱导培养后,两组支架材料均有降解,但实验组较对照组的降解速度明显减慢。扫描电镜可见FG/HA复合支架呈三维立体多孔结构,孔隙率较高,细胞与支架材料附着情况良好。石蜡切片HE染色可见类似正常软骨的组织学特征,甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,实验组的阳性染色程度较高。 结论:在体外单层培养的条件下,ADSASCs可以定向诱导分化为软骨细胞,含10%FBS的软骨诱导液更有利于脂肪成体干细胞向软骨细胞方向增殖和分化。体外培养系统中,纤维蛋白胶/透明质酸(FG/HA)复合支架生物相容性好,孔隙率较高,且有效解决了FG降解速度过快的问题,是一种较为理想的软骨组织工程载体材料。三维环境下培养更有利于干细胞向软骨细胞方向分化,而且有利于软骨细胞表型的维持。

【关键词】：组织工程 脂肪成体干细胞 软骨诱导
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R329
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