牙本质源性蛋白诱导牙周膜干细胞分化及促进牙周再生的实验研究
【摘要】：
牙根发育早期,牙囊细胞、上皮根鞘和牙乳头细胞相互作用,形成了牙根牙周组织。经典理论认为,牙周前体细胞—牙囊细胞穿透断裂的上皮根鞘与牙根接触并相互作用,分化成为成牙骨质细胞并形成牙骨质。我们最近的实验结果显示:牙本质非胶原蛋白能够诱导大鼠牙囊细胞向成牙骨质细胞转化。2007年底,Sonoyama等人利用组织工程方法,将发育期根尖牙乳头细胞与牙周膜干细胞顺序复合多孔HA/TCP材料,在小型猪颌骨内自体移植,利用两种细胞的相互作用,成功构建出具有生物活性的牙根牙周结构,并在人工牙根上成功制作义齿修复。在临床实际操作中,牙周炎患牙的牙周洁治与根面平整,以及局部的抗炎处理是促进牙周再生的前提。通过物理或化学的方法进行牙根表面处理,其目的是为了去除牙根表层的玷污层,改善根面周围的局部微环境,暴露新鲜的牙本质或牙骨质相关蛋白,增加局部的趋化刺激因子,以此来诱导牙周细胞的牙根表面贴附性,促进牙周再生9,10。因此可以推断这些暴露的牙本质相关蛋白有可能作为细胞趋化因子诱导牙周细胞牙根表面的贴附、增殖及分化。
牙本质胶原与非胶原蛋白(DNCPs)是一组细胞外基质蛋白的总称,包括牙本质涎蛋白,磷蛋白和各种多肽生长因子,部分蛋白已被证实可作为细胞因子诱导牙本质周围的多种胚胎或成体干细胞细胞分化。基于牙周发育学的生理基础与牙周治疗的临床操作实际角度,合并我实验室以前的研究结果,我们认为牙本质基质蛋白可能在牙周再生修复过程中发挥着极其重要的作用。牙周膜干细胞是近两年发现的牙周膜内的多潜能前体细胞,在维持牙周自身内环境稳定,保持牙周膜新陈代谢平衡及牙周损伤修复发挥着重要作用。牙周膜干细胞具有自我更新与多向分化能力,可作为牙周关系中各种不同类型细胞的能源储备细胞,因此现在的观点认为牙周膜干细胞在促进牙周再生方面具有重要的研究与实际意义。发育期根尖牙乳头细胞是成牙本质及牙髓细胞的前体细胞,在细胞增殖、分化并合成基质形成了牙根的牙本质和牙髓组织,因此认为牙根的牙乳头细胞在牙根发育,牙周形成过程中发挥着重要作用。本实验拟探讨牙本质非胶原蛋白(DNCPs)对牙周膜干细胞(HPDLSCs)是否具有定向诱导作用。研究体外DNCPs对HPDLSCs的生物学效应,体内在生物支架材料表面促进再生牙周样结构的能力。本研究是第一次引入牙本质来源的基质蛋白诱导牙周膜干细胞在牙本质表面构建牙周组织结构,此研究策略一旦成功,必将对牙周组织再生拓展新的研究思路,为牙周炎的临床治疗提供新的方法。
课题研究目的:
探讨以人牙周膜干细胞(hPDLSCs)作为牙周组织工程种子细胞的可行性;分析牙本质相关蛋白(DNCPs)或根尖牙乳头干细胞基质蛋白对hPDLSCs细胞行为的影响。探讨经DNCPs诱导的hPDLSCs复合脱矿、脱蛋白牙本质的方式或根尖牙乳头干细胞与牙周膜干细胞顺序接种生物支架的方式构建组织工程化的牙根牙周组织的可行性。
课题研究内容
①分离培养人牙周膜干细胞(hPDLSCs)作为牙周再生组织工程的种子细胞,鉴定其干细胞特性及多向分化潜能(成脂、成骨分化)。
②分离培养人发育期根尖牙乳头干细胞,鉴定其干细胞特性,观察种子细胞与生物支架材料复合后的生长特点,生成基质的特性;
②体外观察DNCPs对牙周膜干细胞(hPDLSCs)增殖与分化能力的影响;
③体外观察DNCPs对牙周膜干细胞(hPDLSCs)细胞大体形态的影响,细胞牙本质表面黏附能力的影响;
④体内观察DNCPs能否诱导牙周膜干细胞(hPDLSCs)在牙本质表面形成牙周样结构;
⑤hPDLSCs与hRAPSCs顺序接种生物支架材料,异位移植观察根尖牙乳头细胞生成的基质对hPDLSCs牙周再生能力的影响;
⑥利用明胶微球缓释特性,合成适合hPDLSCs生长分化及组织再生的胶原-羟基磷灰石-明胶微球/缓释TGF-β1的多孔支架材料。
主要研究方法
1利用酶消化结合组织块法在成人健康牙周膜中培育人牙周膜细胞;通过收集多个克隆化生长的细胞,并将其培育在间充质干细胞培养液内,获得牙周膜干细胞。间充质干细胞标志物STRO-1检测细胞;干细胞成骨诱导与成脂诱导,观察多向分化能力。
2分离年轻智齿的根尖部分组织,利用酶消化法培养了根尖牙乳头细胞,对细胞进行了干细胞鉴定与多向诱导分化。细胞接种珊瑚羟基磷灰石支架,观察牙本质基质生成情况,免疫组化染色观察基质特性。
3 DNCPs溶解于DMEM培养基,精调pH值制成1ug/ml溶液。以DNCPs溶解的DMEM培养基(2%胎牛血清,50ug/ml维生素C, 2 mmol/L谷胺酰胺, 100 U /ml青霉素, 100μg/ml链霉素)为A液;不添加DNCPs的DMEM培养基为B液。以MTT法,BrdU吸收率,流式细胞仪检测A液与B液孵育的牙周膜干细胞增殖活性。
4以倒置显微镜,扫描显微镜观察经A液与B液孵育的牙周膜细胞大体形态变化;以RT-PCR为手段检测成骨标志物COL, OCN, ALP的PCR水平变化;检测诱导前后碱磷酶变化;检测诱导前后对对牙周膜干细胞矿化形成能力的影响。
5改良方法制作部分脱矿、脱蛋白牙本质支架材料,干细胞体外支架接种,观察细胞贴附与伸展效果;观察DNCPs诱导下对牙周膜干细胞平皿贴壁速度与能力的影响。
6 DNCPs孵育的HPDLSCs接种CCRD支架,裸鼠体内移植,四周后观察牙周组织在牙本质表面再生的情况。
7制作Collagen/HA/GM具有缓释支架材料,观察生长因子缓释效果。支架接种牙周膜干细胞,裸鼠体内移植,观察组织再生及因子缓释效果。
课题主要研究结果
①利用酶消化结合组织块法在成人健康牙周膜和培育了人牙周膜细胞(hPDLSCs);对干细胞特性进行了系统研究:包括主要干细胞标志物检测;克隆形成能力分析;多向分化能力检测。牙周膜细胞的间充质干细胞标志物STRO-1检出细胞群29.01%为阳性;干细胞成骨诱导3周,茜素红染色,细胞周围出现大量、片状矿化基质;成脂诱导液干细胞孵育3周,油红O染色,大量细胞出现脂滴阳性染色。
②利用酶消化法在根尖组织中分离、培养了人根尖牙乳头干细胞(hRAPSCs)。
③经MTT法检测DNCPs可以促进牙周膜干细胞(hPDLSCs)增殖,DNCPs孵育的hPDLSCs的BrdU吸收率有统计意义的提高;DNCPs处理的hPDLSCs细胞分裂相增加。DNCPs孵育的hPDLSCs细胞贴壁能力明显增强。
④经DNCPs诱导的牙周膜干细胞(hPDLSCs)可以增加COL, OCN, ALP的PCR水平,矿化基质形成能力明显增强。形态学检测牙周膜干细胞向成牙骨质细胞分化。
⑤DNCPs诱导的牙周膜干细胞(hPDLSCs)可以促进其在牙本质表面牙骨质样结构与牙周纤维样结构再生。
⑥根尖牙乳头干细胞(hRAPSCs)在生物支架表面形成了矿化的牙本质基质,这种牙本质基质可诱导牙周膜干细胞在其表面的牙周再生。
⑦构建出适合hPDLSCs生长分化的Collagen/HA/GM具有缓释TGF-β1功能的支架材料。
结论
我们的研究证实,DNCPs是有效的刺激因子可促进牙周膜干细胞增殖及成牙骨质向分化,促使HPDLSCs向牙骨质细胞的形态改变,进而诱导HPDLSCs的牙周组织发生。因此,这些发现对于指导临床如何促进牙周再生是具有重要意义的。但DNCPs有效的促牙周再生因子是什么,以及它与其他促牙周再生因子相互之间的关系如何,仍然是我们研究的课题。
【关键词】：组织工程 牙周再生 牙本质非胶原蛋白 牙周膜干细胞 根尖牙乳头干细胞 缓释系统 明胶 转化生长因子 【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R78
【目录】：
- 缩略语表5-6
- 中文摘要6-11
- 英文摘要11-21
- 前言21-24
- 文献回顾24-39
- 第一部分：干细胞的分离、培养及生物特性分析39-47
- 实验一、分离培养牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs）39-43
- 1 材料和方法39-40
- 2 结果40-41
- 3 讨论41-43
- 实验二、分离培养人发育期根尖牙乳头干细胞(human root apical papilla stem cells, hRAPSCs)43-47
- 1 材料和方法43-45
- 2 结果45-46
- 3 讨论46-47
- 第二部分：DNCPs 对HPDLSCs 生物活性的影响47-62
- 实验一、DNCPs 对HPDLSCs 增殖特性的影响47-51
- 1 材料和方法47-49
- 2 结果49
- 3 讨论49-51
- 实验二、DNCPs 对HPDLSCs 分化能力的影响51-56
- 1 材料与方法51-53
- 2 结果53-54
- 3 讨论54-56
- 实验三、脱矿脱蛋白牙本质材料制备及DNCPs 对HPDLSCs 黏附能力的影响56-59
- 1 材料与方法56-58
- 2 结果58
- 3 讨论58-59
- 实验四、DNCPs 对HPDLSCs 牙周再生能力的影响59-62
- 1 材料与方法59
- 2 结果59-60
- 3 讨论60-62
- 第三部分:制备用于牙周组织工程的多孔明胶/羟基磷灰石/胶原缓释TGF-β1 支架材料62-70
- 实验一、TGF-β1 明胶缓释微球的制备63-66
- 1 材料与方法63-64
- 2 结果64
- 3 讨论64-66
- 实验二、Gelatin/HA/Collagen 缓释支架材料的制备及生物相容性研究66-70
- 1 材料与方法66-67
- 2 结果67-68
- 3 讨论68-70
- 小结70-71
- 附录71-82
- 个人简历和研究成果82-84
- 致谢84-86
- 参考文献86-97
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