NDRG2在大鼠睾丸发育中的表达及其与生精细胞凋亡的关系

【摘要】： 目的 NDRG2与NDRG1,NDRG3和NDRG4共同组成NDRG家族,该家族成员可能与细胞的增殖和分化相关,但其具体的生物学功能有待于进一步研究。在前期的研究中我们通过免疫组织化学染色观察到NDRG2在成年人和小鼠睾丸内均表达定位于睾丸间质细胞,而在生精细胞内未见明显的阳性着色,推测其可能参与睾丸间质细胞睾酮的分泌与调节,进而调控精子的发生,因此本实验的目的在于探讨NDRG2在睾丸发育与精子发生过程中的作用及其机制。0 方法 1.利用RT-PCR、蛋白质免疫印迹杂交及免疫组织化学等方法对比研究出生后大鼠睾丸发育不同阶段(1、5、15、21、35和75 d)中NDRG2的表达与定位;并分离21、35和75 d大鼠睾丸间质细胞和生精细胞,利用RT-PCR和蛋白质免疫印迹杂交分析和验证NDRG2在大鼠睾丸不同发育阶段中表达的差异性。 2.建立成年大鼠单剂量MAA(650 mg/kg)腹腔注射诱导精母细胞凋亡模型,采用TUNEL、RT-PCR、蛋白质免疫印迹杂交、免疫组织化学、间接免疫荧光和激光显微切割技术分析NDRG2在生精细胞凋亡过程中表达的变化,探讨NDRG2与生精细胞凋亡之间的关系。 3.青春期大鼠睾丸内生精细胞自发性凋亡达到顶峰,建立青春期(21 d)大鼠隐睾模型,通过TUNEL染色验证该模型、运用免疫组织化学和间接免疫荧光等方法分析NDRG2在隐睾和对照侧睾丸表达的差异,并且分离术后不同时间点的间质细胞和生精细胞,运用免疫印迹杂交检测NDRG2和p53的表达变化。 结果 1.RT-PCR和Western blot结果均显示NDRG2在出生后1 d大鼠睾丸内即有表达,随后逐渐升高,至青春期达到顶峰(21和35 d),在成年期其表达反而下降。免疫组织化学结果显示NDRG2持续表达于睾丸间质细胞,但在睾丸发育不同阶段,其在生精小管内的表达却存在明显的差异。在新生期(1和5 d)主要表达于原始生殖细胞,而不表达于支持细胞;在15和21 d大鼠睾丸,NDRG2在生精小管内主要表达于精母细胞,而精原细胞和支持细胞未见阳性着色;在35 d大鼠睾丸,NDRG2在生精小管内主要表达于精母细胞和圆形精子细胞;在成年(75 d)大鼠,生精小管内几乎未见NDRG2阳性着色。分离纯化21,35和75 d大鼠睾丸生精细胞,采用RT-PCR和Western blot进一步验证了NDRG2在青春期大鼠生精细胞内高表达,而在成年大鼠生精细胞内几乎不表达。分离纯化21,35和75 d大鼠睾丸间质细胞,结果显示NDRG2在这三个时间点间质细胞内均有较强的表达,但相互间无明显差异。 2.MAA腹腔注射3和6 h与对照组相比未见显著性差异,但MAA诱导12 h后,成年大鼠睾丸内出现大量初级精母细胞的凋亡,主要集中在生精周期的第X-XIII期,通过分离生精细胞和激光显微切割技术均检测到NDRG2在MAA诱导12 h后在生精细胞的表达上调,免疫组织化学和间接免疫荧光结果均显示NDRG2在自发性和MAA诱导凋亡的生精细胞中均高表达。 3.建立21 d大鼠单侧隐睾模型,术后7 d和14 d,隐睾侧睾丸重量明显减轻,凋亡生精细胞数明显升高,免疫组织化学与间接免疫荧光结果显示NDRG2在自发性和热刺激诱导凋亡的生精细胞内表达均明显上调,但在一些正常的精母细胞和圆形精子内仍存在一定量的表达,并且NDRG2在隐睾侧间质细胞的表达强度明显降低。分离纯化术后不同时间点隐睾侧和对照侧睾丸生精细胞,发现NDRG2和p53在术后7 d隐睾侧生精细胞的表达量明显上调,而在隐睾后14 d未见明显差异,可能与生精细胞的凋亡与脱落有关;分离纯化术后不同时间点隐睾侧和对照侧睾丸间质细胞,进一步证实了NDRG2在术后7和14 d隐睾侧间质细胞的表达量减少。 结论 1. NDRG2在大鼠睾丸发育不同阶段持续表达于间质细胞,可能参与睾丸早期发育和睾酮的分泌与调节。 2. NDRG2在大鼠睾丸发育过程中在生精细胞的表达存在较大差异,在青春期前在生精细胞有较高水平的表达,但在成年期表达量很低,提示NDRG2可能参与睾丸发育早期生精细胞增殖与分化的调节。 3. NDRG2在MAA和热刺激诱导的生精细胞凋亡中表达均明显上调,并且在青春期和成年期大鼠睾丸自发性生精细胞凋亡中均存在较强的表达,提示NDRG2可能参与了生精细胞凋亡的调控。