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针对乳腺癌骨转移的树突状细胞/肿瘤融合瘤苗研究

张云飞  
【摘要】: 骨骼系统是恶性肿瘤转移常见的靶器官,多见于乳腺癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、子宫癌、直肠癌、甲状腺癌、肾癌等。骨转移一旦发生其后果严重,会引起严重的疼痛,病理性骨折,严重的神经压迫症状及致命的高血钙症严重影响了患者的生活质量及生存时间。乳腺癌是妇女常见的恶性肿瘤,约70%的乳腺癌患者发生骨转移,骨转移占乳腺癌远处转移的70%,是临床上一种常见的严重疾病。然而医学发展至今尚无有效的方法来预防和治疗乳腺癌骨转移。姑息性的放疗及手术治疗偶尔被用来缩小肿瘤大小,化疗通常因为耐药而导致失败,因而迫切需要新的治疗手段。 肿瘤生物治疗被称为除手术、化疗、放疗外的第四种肿瘤治疗方式,显示了良好的应用前景。作为肿瘤生物治疗研究热点之一的树突状细胞(Dendritic Cell, DC)是目前已知的功能最强的抗原提呈细胞(Antigen Presenting Cell, APC),其在抗肿瘤免疫反应中发挥极其重要的作用。目前主要有俩种DC相关肿瘤疫苗的研究。第一种为荷载已知肿瘤抗原的DC肿瘤疫苗,主要包括:肿瘤相关抗原肽负载DCs,肿瘤相关抗原蛋白负载DCs,及编码肿瘤相关抗原(Tumor Associate Antigen, TAA)的核酸(Deoxyribonucleic acid, Ribonucleic acid, DNA, RNA)转染DCs。其能够诱导机体产生靶向于肿瘤抗原肽的特异性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte, CTL)应答,但由于目前发现的特异性TAA非常有限,并且存在肿瘤抗原异质性及人主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex, MHC)分子多态性等问题,其临床应用受到很大限制。第二种为荷载整个肿瘤细胞抗原的DC疫苗,主要包括: DC荷载凋亡的肿瘤细胞或肿瘤细胞裂解物、荷载肿瘤细胞的酸洗脱物、转染肿瘤细胞的RNA及DC/肿瘤细胞融合瘤苗等。此种DC疫苗无需鉴定TAA,其理论上可靶向于多种肿瘤抗原包括已知的及未知的,并能够引发多克隆的CTL免疫应答,因而极大的扩大了DC疫苗的应用范围并提高了其有效性。其中, DC/肿瘤细胞融合瘤苗与其它DC疫苗相比,制备简单直接,并且有其独特的优势,其可通过MHC I类途径内源性处理及递呈肿瘤抗原并最终活化CD8+ CTL (Cluster of Differentiation, CD抗原决定簇),其是抗肿瘤免疫反应的主要效应细胞,此外其也可通过MHC II类途径处理抗并激活CD4+辅助性T细胞(T helper cell, Th),从而协助效应细胞发挥作用。而凋亡肿瘤细胞,肿瘤细胞裂解物及肿瘤细胞的酸洗脱物荷载DC主要以MHC II类途径递呈抗原,活化CD4+ Th细胞。肿瘤细胞总RNA转染DC虽可通过MHCI类途径进行递呈,但其需进行体外RNA扩增及有效DC转染,技术要求及操作比较复杂。鉴于DC/肿瘤细胞融合策略的上述优点,本课题采用细胞融合技术构建DC/乳腺癌细胞融合疫苗。在融合疫苗策略中,自体肿瘤细胞被首选使用,因为其肿瘤抗原表达谱包括已知及未知的与荷瘤宿主匹配最佳。然而针对乳腺癌骨转移患者,其自体乳腺癌细胞获得非常困难,因为大多患者其原发病灶已不存在,继发灶常为多发,因而无手术指征,即使通过手术获取肿瘤组织,往往会因为原代培养时间长,过程复杂及病原菌污染等无法获得足够活力及数量的肿瘤细胞。为解决这一问题,本课题首次使用异体乳腺癌细胞系MCF7代替自体乳腺癌细胞与DC融合,实现将肿瘤抗原导入DC的目的,并研究其抗自体乳腺癌细胞的免疫效应。使其在乳腺癌骨转移患者的应用成为可能,并为DC/肿瘤细胞融合细胞的应用开辟新的途径。 目的为使DC/肿瘤细胞融合瘤苗应用于乳腺癌骨转移患者,本研究采用异体乳腺癌细胞MCF7代替自体乳腺癌细胞制备融合瘤苗并研究其体外抗肿瘤免疫效应,以期为DC肿瘤细胞的应用开辟新的途径。 方法使用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage Colony-Stimulating Factor, GM-CSF),白细胞介素4(Interleukin 4, IL4)诱导乳腺癌患者外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC)DC分化,使用电融合仪制备DC/MCF7融合细胞,流式细胞仪分析融合效率,激光共聚焦显微镜鉴定真实融合细胞。融合细胞与T(与DC同源)细胞共培养后,使用酶联免疫吸附斑点(Enzyme-linked immunosorbent spot, Elispot)法检测T细胞分泌伽玛干扰素(Interferon-gamma,IFNγ)频数,使用乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase, LDH)释放法检测效应T细胞杀伤靶细胞(自体乳腺癌细胞)能力。 结果外周血经体外诱导培养7天后获得具有典型形态及表型的DC,使用电融合仪制备DC/MCF7融合细胞,经流式细胞仪检测融合效率为45%左右,激光共聚焦显微镜直接观察到了双阳性的融合细胞。T细胞在DC/MCF7融合细胞刺激下,可产生明显的细胞增殖簇,在接触自体乳腺癌细胞时分泌高水平IFNγ,并能产生针对自体乳腺癌细胞的CTL效应,并具有肿瘤抗原特异性及MHC限制性。此种免疫原性与DC/自体乳腺癌融合细胞瘤苗具有可比性。 结论同种异体乳腺癌细胞系MCF7可代替自体乳腺癌细胞与DC融合,实现将肿瘤抗原导入DC的目的,DC/MCF7融合细胞能诱导产生针对自体乳腺癌细胞的免疫效应,与DC/自体乳腺癌细胞融合瘤苗具有可比性。此研究使为DC/肿瘤细胞融合瘤苗在乳腺癌骨转移患者的应用提供证据及基础,并为融合瘤苗的应用开辟新的途径。


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