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《第四军医大学》 2009年
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模拟失重对人脐静脉内皮细胞iNOS表达的影响及其转录调控机制研究

王永春  
【摘要】: 中长期载人航天飞行中的失重环境会对机体心血管系统产生不良影响,主要表现为运动耐力及立位耐力降低,严重影响航天员的健康及航天任务的完成。研究表明,失重后立位耐力不良的发生机理可能与失重后血容量减少、压力反射敏感性降低、静脉顺应性下降及肌肉萎缩等因素有关,但其确切发生机制仍不清楚。目前认为,失重后立位耐力不良的发生涉及多重复杂机制,不论在人体实验中,还是在动物实验中,多家实验室均发现血管系统的变化可能是导致心血管失调的重要因素。血管收缩功能不良在失重后立位耐力降低的发生发展中可能起着重要作用,但这种血管低反应性的确切机制仍待进一步阐明。 内皮细胞广泛分布于机体血管的内表面,相互之间密切联系而形成一层天然的物理屏障,从而维持着血管壁的完整性。由于其在血管壁中的特殊位置,故内皮细胞可以对局部血管的血压、氧分压及血流变化迅速作出反应,通过合成和分泌多种血管活性物质作用于血管平滑肌,从而调节血管的舒张和收缩。一氧化氮(NO)可由体内多种组织细胞分泌,作为一种内源性的细胞内信使分子在体内多种生物学过程中担当重要角色,尤其在心血管功能的调控中发挥重要作用。机体的NO主要由一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸生成的,目前发现的NOS有三种同工酶:神经元型(nNOS)、内皮型(eNOS)和诱导型(iNOS)。nNOS和eNOS可在体内持续表达,主要参与生理水平NO的调节;而iNOS在生理状态下不表达,当诱导因素使其表达后,会持续释放大量的NO,产生一系列生理及病理作用。有报道指出内皮细胞对失重刺激具有高度敏感性,表现为失重或模拟失重环境下,内皮细胞可发生形态及基因表达的改变。大量的研究证明,尾吊模拟失重后大鼠机体NOS的活性增加。进一步研究发现,尾吊模拟失重可致大鼠股动脉等多种血管系统中出现iNOS的活性及表达量的增高,并且认为失重或模拟失重后内皮细胞释放的大量非生理浓度的NO是航天后机体血管收缩不良的重要原因。然而,失重或模拟失重导致的内皮细胞iNOS表达变化及其调控机制尚未见报道。为了探讨上述问题,我们以人脐静脉内皮细胞为研究对象,观察了回转器模拟失重致HUVEC-C iNOS的表达变化,进而探讨了其在转录水平的调节机制。本研究主要结果与发现如下: 1.模拟失重对人脐静脉内皮细胞系HUVEC-C iNOS表达的影响本研究观察了回转器模拟失重24 h对人脐静脉内皮细胞系HUVEC-C iNOS表达的影响,结果发现:地面静止对照组与垂直旋转对照组iNOS mRNA及蛋白表达均较低,而24 h回转器模拟失重后,HUVEC-C iNOS mRNA及蛋白表达量显著增高,表明24 h模拟失重可致HUVEC-C iNOS mRNA和蛋白出现异常表达。转染了含有7233 bp的iNOS启动子荧光素酶报告基因系统phiNOS(7.2)Luc HUVEC-C在模拟失重24 h后,荧光素酶相对活性约为1G对照组的2.29倍,表明回转器模拟失重24 h可致HUVEC-C iNOS在转录水平被激活。 2.模拟失重对HUVEC-C NF-κB及AP-1转录活性的影响本研究利用HUVEC-C转染NF-κB及AP-1报告基因的方法,观察了回转器模拟失重24 h对HUVEC-C转录因子NF-κB及AP-1转录活性的影响。结果发现:回转器模拟失重24 h与1G对照组相比,模拟失重可显著抑制NF-κB依赖的转录活性,抑制率为48%;以同样的方法发现,回转器模拟失重24 h与1G对照组相比可显著抑制AP-1依赖的转录活性,抑制率为38%。而两组的阴性对照质粒pCIS-CK转染HUVEC-C后,回转器模拟失重24 h与地面1G对照组的荧光素酶相对活性相比无显著差别,表明回转器模拟失重24 h可使HUVEC-C中转录因子NF-κB及AP-1的转录活性显著降低。 3.模拟失重致HUVEC-C iNOS异常表达机制的研究本研究通过改变转录因子NF-κB及AP-1的活性,观察了模拟失重24 h后HUVEC-C iNOS表达的变化,进而明确回转器模拟失重24 h HUVEC-C iNOS异常表达在转录水平的调节机制。结果发现:应用50μM NF-κB阻断剂PDTC后模拟失重24 h,HUVEC-C iNOS mRNA、蛋白表达及转染荧光素酶启动子报告基因的相对荧光量与单纯模拟失重组相比未见显著变化,提示NF-κB未参与模拟失重环境下HUVEC-C iNOS的异常表达调控。应用20μM AP-1特异阻断剂SP600125后与单纯模拟失重组相比,HUVEC-C iNOS mRNA、蛋白及转染了phiNOS(7.2)Luc的相对荧光量均出现显著升高,而过表达AP-1后,与单纯模拟失重组相比HUVEC-C iNOS mRNA、蛋白表达及相对荧光活性均出现明显抑制。以上结果提示,模拟失重24 h所致的HUVEC-C iNOS表达的增高部分地与转录因子AP-1的活性降低有关,而非NF-κB在起作用。 4.模拟失重致HUVEC-C iNOS异常表达的转录调控结合区域研究本研究利用构建的不同截短长度的iNOS启动子荧光素酶报告基因系统,通过观察回转器模拟失重24 h后转染了各片段的HUVEC-C相对荧光量的变化,从而明确模拟失重24 h致HUVEC-C iNOS异常表达的转录因子在iNOS启动子上游结合作用区域。结果发现:转染了phiNOS(0.6)Luc和phiNOS(1.0)Luc HUVEC-C在模拟失重24 h后,HUVEC-C细胞的荧光素酶活性与1G对照组相比无显著差别,表明iNOS启动子转录起始位点上游1000 bp内无回转器模拟失重24 h诱发iNOS异常表达的转录因子结合位点。 总之,本研究利用细胞回转器模拟失重效应,观察了模拟失重24 h及1G重力环境下HUVEC-C iNOS mRNA、蛋白和启动子激活水平的变化,进而探讨了模拟失重致HUVEC-C iNOS异常表达在转录水平的调控机制。得出了如下结论:模拟失重24 h可致HUVEC-C iNOS mRNA、蛋白异常表达及在转录水平被激活;模拟失重24 h可降低HUVEC-C转录因子NF-κB及AP-1的转录活性;模拟失重24 h导致的HUVEC-C iNOS异常表达与转录因子AP-1的转录活性降低有关,而与NF-κB的活性降低无关;iNOS启动子转录起始位点上游1000 bp范围内无模拟失重24 h诱发HUVEC-C iNOS异常表达的转录因子结合位点。本研究结果有助于深化对失重致血管功能变化机制的认识,对失重致立位耐力不良的防护提供新的思路和理论依据。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R85

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【参考文献】
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