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《第四军医大学》 2009年
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B19-XA株VP1独特区蛋白结构与免疫的初步研究

聂晓晶  
【摘要】: 人细小病毒B19(Human parvovirus B19,简称B19病毒)属于细小病毒科细小病毒属,我国人群有较高的感染率和发病率。自我们于1990年首次证实我国存在B19病毒感染以后,国内多个研究机构证明其是我国孕妇非免疫性流产、儿童急性再生障碍性贫血危象、急性血小板减少性紫癜等疾病的重要病因之一。 B19病毒由一个二十面体衣壳蛋白包裹一条单链DNA(5596bp)组成,这条单链DNA编码一个非结构蛋白(NS1)、两个结构蛋白(VP1,VP2)和两个衣壳蛋白(7.5kDa和11kDa)。VP2蛋白(58kDa)包含在VP1蛋白(83kDa)中,两者的区别仅是VP1蛋白N末端的227个氨基酸,这227个氨基酸所组成的蛋白叫做VP1独特区蛋白(VP1 unique protein,VP1uprotein)。 B19病毒核苷酸序列有着较大的变异,据此可分为三个基因型:Ⅰ型(标准型)、Ⅱ型(类似A6型和类似LaLi型)、Ⅲ型(类似V9型),不同型别间核苷酸序列变异率为10%。我们在国家自然科学基金课题(39870021)的资助下,对B19病毒中国流行株(B19-XA株)进行基因变异的研究,发现B19-XA株存在较多变异。尤其是VPlu核苷酸存在的变异,将影响B19-XA株独特的免疫学特性,这是因为VPlu蛋白大部分暴露在病毒表面,能刺激机体产生中和性抗体,且近期研究发现VPlu蛋白有磷酸脂酶A_2(phospholipase A_2,PLA_2)活性。PLA_2具有水解脂肪酸和磷脂的能力,在很多疾病的发生和发展中扮演重要角色。 鉴于B19病毒有多个基因型,不同的蛋白抗原位点对研制诊断试剂及疫苗有很大影响,以及VPlu蛋白在B19病毒致病过程中起着重要作用,故有必要研究B19-XA株VPlu蛋白的结构对免疫的影响,这将有助于我国人群B19病毒感染的防治,能促进B19病毒致病机理及预防疫苗的研究。 研究目的: 本实验目的是表达纯化VPlu蛋白,通过软件分析及圆二色谱仪测定VPlu蛋白一、二级结构;同时用VPlu蛋白免疫动物,测定抗VPlu蛋白抗体滴度,并行免疫后小鼠心、肝、肺、肠、关节滑膜组织病理检查;体外观察VPlu蛋白对T淋巴细胞应答功能的影响;以及将VPlu蛋白用于建立酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA),判断其检测B19病毒感染的可行性。以初步揭示B19-XA株VPlu蛋白的免疫原性,部分揭示B19病毒感染的致病机理,促进B19病毒感染的防治。 实验方法: 1.测序证实pQE30-VPlu质粒中含有VPlu片段将我科构建并保存的pQE30-VPlu质粒送生物技术公司测序证实包含VPlu基因片段。 2.原核表达并纯化B19-XA株VPlu蛋白将含有pQE30-VPlu质粒的E.coli M15菌发酵,低温条件下IPTG诱导表达VPlu融合蛋白,通过离子交换、分子筛纯化重组蛋白,SDS-PAGE鉴定VPlu蛋白及纯度情况。 3.B19-XA株VPlu蛋白结构分析与测定通过AnthePro 5.0软件分析VPlu蛋白一级结构,Hierarchical Neural NetWork method软件分析VPlu蛋白二级结构,圆二色谱仪测定VPlu蛋白二级结构。 4.B19-XA株VPlu蛋白免疫学特性研究体外观察VPlu蛋白对BALB/c小鼠淋巴细胞应答功能的影响;体内实验通过VPlu蛋白免疫BALB/c小鼠,然后测定抗VPlu蛋白抗体滴度,判断VPlu蛋白抗原性,并对免疫后小鼠心、肝、肺、肠、关节滑膜行光镜和电镜检查。 5.构建ELISA检测B19病毒抗体体系采用B19-XA株VPlu蛋白包被酶标板,优化该检测B19病毒IgG、IgM体系,与聚合酶链反应(PCR)、德国B19病毒抗体检测试剂盒进行比较,评价其一致性。 实验结果: 1.通过Hierarchical Neural Network method分析和圆二色谱仪测定B19-XA株VPlu蛋白二级结构,无规线团所占比例均较大,分别为60.00%和46.10%。 2.用ELISA法检测B19-XA株VPlu蛋白免疫BABL/c小鼠产生的抗B19-XA株VPlu蛋白抗体效价,抗原包被量为20ng~50ng间为最佳包被量,小鼠血清稀释达1∶16000时为阳性(OD值2.04),提示B19-XA株VPlu蛋白免疫原性和反应原性好。 3.经B19-XA株VPlu蛋白免疫的BABL/c小鼠的心脏、肝脏、关节滑膜存在明显病理改变。心脏病理改变为:光镜提示心肌肌纤维间隙增宽、血管扩张;电镜提示心肌肌纤维溶解、肌纤维间隙大、炎性细胞浸润、肌丝间隙增宽、线粒体水肿及空泡化。肝脏病理改变为:光镜提示有坏死区、血窦扩张;电镜提示肝细胞有突起,微绒毛肿胀及质地变实、电子密度增高。关节滑膜病理改变为:光镜提示慢性炎症改变;电镜提示滑膜细胞增多、胶原成分增多。 4.用B19-XA株VPlu蛋白构建的B19病毒抗体检测ELISA体系与腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒、疱疹病毒抗体阳性血清无交叉反应。最佳包被量为25ng/孔,标本血清最佳稀释倍数为1∶200。其检测B19IgM敏感性为88.37%,特异性为96.15%,与PCR方法一致性好,kappa值>0.75;与Parvovirus B19 IgM ELISA Kit符合性好(符合率=96.8%)。与Parvovirus B19 IgG ELISA Kit比较kappa值>0.75,两种检测方法一致性好。 结论: 1.本研究首次发现B19-XA株VPlu蛋白二级结构可变区所占比例大。揭示其能因此刺激机体产生多种抗体(包括自身抗体),从而引起机体多系统多器官的病变,可能与B19病毒感染临床表现复杂有关。 2.B19-XA株VPlu蛋白免疫BALB/c小鼠后能产生特异性抗体,且经ELISA检测提示血清稀释度达1∶16000时仍为阳性,说明B19-XA株VPlu蛋白抗原性好。 3.B19-XA株VPlu蛋白免疫后的BABL/c小鼠的心脏、肝脏、关节滑膜存在明显病理改变,提示VPlu蛋白在B19病毒致病谱广中起重要作用,这可能与VPlu蛋白具有PLA_2活性有关。 4.用VPlu蛋白构建的B19病毒抗体检测ELISA体系具有灵敏度高、特异性强、经济、方便等优点。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R373

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【引证文献】
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