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《第四军医大学》 2009年
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SDF-1/CXCR4轴在肺癌转移中作用与机制的研究

汪健  
【摘要】: 目的与背景肺癌是目前发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。转移是其治疗失败和患者死亡的主要原因。已有研究表明趋化因子及其受体与肿瘤侵袭和转移密切相关,可能是通过和炎性细胞浸润相似的机制参与了肿瘤的侵袭和转移。本课题旨在研究趋化因子SDF-1及其受体CXCR4构成的特异性轴在肺癌侵袭和转移中的作用与机制,为肺癌转移的防治提供新的思路和靶点。 材料与方法 (1)收集临床非小细胞肺癌(NSCLC)组织标本60例,分别取癌组织、癌旁组织及正常肺组织,进行免疫组化和RT-PCR检测其CXCR4的表达,分析肺癌组织与癌旁、正常肺组织间CXCR4表达的差异;按病理类型、分化程度及临床TNM分期分别进行分组,分析CXCR4的表达与病理类型、分化程度及临床TNM分期的相关性。 (2)体外构建pEGFP-C1-CXCR4质粒,稳定转染肺癌A549细胞系,建立CXCR4过表达的A549细胞系(CXCR4-A549)。在CXCR4的特异性配体SDF-1的诱导下,分别对CXCR4-A549与A549两组细胞进行体外趋化和侵袭实验,并建立裸鼠皮下接种肺癌细胞的动物模型,分析上调CXCR4的表达后,对肺癌细胞体外迁移能力和体内成瘤及转移的能力的影响。 (3)为探讨SDF-1/CXCR4在肺癌侵袭和转移中的作用机制:①利用流式细胞仪检测CXCR4-A549与A549两组细胞的增殖和凋亡,分析上调CXCR4的表达后,对细胞生长周期的影响;②利用流式细胞仪检测两组细胞钙离子内流强度,分析SDF-1/CXCR4对钙离子通道活性的调控;③采用Western blot实验检测两组细胞PI3K/AKT、MAPK/ERK相关信号通路的活性,分析SDF-1/CXCR4可能激活的下游信号分子;④采用Western blot和RT-PCR检测两组细胞肿瘤转移相关基因VEGF-C、MMP-2的表达,探讨SDF-1/CXCR4与VEGF-C、MMP-2的相互作用关系。 研究结果 (1)免疫组化检测结果显示:肺癌组织中CXCR4的表达主要定位于胞膜和胞浆,呈棕黄色强阳性染色,其表达率为83.3%(50/60),而在正常肺和癌旁组织中则无表达;半定量RT-PCR检测肺癌组织中CXCR4 mRNA表达为83.3% (50/60),与癌旁组织38.3% (23/60)、正常肺组织31.7% (19/60)差异显著;免疫组化检测肺鳞癌和腺癌中CXCR4的表达分别为79.3%(23/29),87.1%(27/31),鳞、腺癌间无显著差异(p0.05);在高分化癌中CXCR4的表达为76.9%(10/13),中分化癌中为82.1%(23/28),低分化癌为84.2%(16/19),虽然随分化程度降低而呈增高趋势,但三者之间无统计学差异(p0.05);TNM分期中Ⅰ期患者CXCR4的表达率为72.7%(8/11),Ⅱ期患者为83.9%(26/31),Ⅲ期患者为88.9%(16/18),三期之间表达有显著相关性。实验结果提示CXCR4在非小细胞肺癌中的表达具有:与癌细胞类型无关,随细胞分化程度降低而增强趋势,而与临床TNM分期密切相关,分期越晚、表达越高的特征。表明CXCR4与肺癌侵袭和转移密切相关,检测CXCR4的表达有可能作为判断转移和预后的依据。 (2)经脂质体转染A549细胞,建立了稳定转染的CXCR4-A549细胞系,Western blot检测表明,CXCR4-A549较未转染的细胞CXCR4蛋白表达明显增高,说明构建的CXCR4-A549细胞可以上调CXCR4的表达。体外侵袭实验表明,上调CXCR4表达后,CXCR4-A549细胞的侵袭能力平均升高了1.62倍(p0.05);在SDF-1的诱导作用下,CXCR4-A549细胞趋化作用较A549细胞更为明显(p0.05)。体内实验中,CXCR4-A549与A549细胞接种的各6只裸鼠致瘤率均为100%,平均瘤重分别为:4.37±0.96g,3.24±1.16g,两组差异显著(p0.05)。CXCR4-A549组6只鼠肺内均可见明显转移瘤形成,而A549组仅2只肺内有瘤细胞浸润,无转移瘤形成。表明过表达CXCR4的A549细胞在SDF-1的趋化作用下,其侵袭、成瘤及转移能力均有明显增强。 (3)流式细胞仪检测显示:与A549细胞相比,CXCR4-A549细胞周期S期和G2期的比例升高,增殖指数(PI)升高9.72%,凋亡细胞比率减少3.60%。提示SDF-1/CXCR4可以促进细胞增殖,但两组无明显差异(p0.05)。钙离子内流实验中,用100ng/ml SDF-1诱导20s,CXCR4-A549和A5459细胞内荧光显著增强,随时间延后而迅速的下降,两组间钙离子浓度有明显差异(p0.05),表明SDF-1的作用具有时间依赖性。Western blot检测显示,在SDF-1作用30min时,ERK与AKT磷酸化明显。提示SDF-1/CXCR4可以活化PI3K/ERK和MAPK/AKT,激活下游分子启动肺癌细胞的侵袭和转移。在上调CXCR4表达的CXCR4-A549细胞中,VEGF-C和MMP-2在mRNA和蛋白水平均明显增高,而给予SDF-1后,其增高趋势更为明显(p0.05)。说明SDF-1/CXCR4与VEGF-C、MMP-2在肺癌侵袭和转移中具有协同作用。 结论 (1)通过免疫组化法检测,揭示了CXCR4在非小细胞癌中表达的基本特征是:癌组织中高于癌旁和正常肺组织;其表达与病理类型无关,随癌细胞分化程度降低而增高趋势,但与临床TNM分期密切相关,有望成为判断NSCLC转移和预后的指标之一。 (2)成功构建CXCR4稳定表达的肺癌A549细胞系,经体外和体内实验证明,可上调CXCR4的表达;在SDF-1作用下,其体外迁移和体内成瘤、转移能力显著增强。说明SDF-1/CXCR4在肺癌侵袭和转移中发挥重要作用。 (3)SDF-1/CXCR4轴可通过激活肺癌细胞钙离子内流、MAPK/ERK与PI3K/AKT信号通路,启动肺癌侵袭和转移过程,并与肿瘤转移相关基因MMPs、VEGF在肺癌侵袭和转移中具有协同作用。 本研究较系统地分析了SDF-1/CXCR4与肺癌的相关性,证实了SDF-1/CXCR4在肺癌侵袭和转移中的基本作用,初步阐明了SDF-1/CXCR4在肺癌侵袭转移中的作用机制,为进一步研究肺癌转移机制和临床诊断治疗提供了有益的帮助。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R734.2

【引证文献】
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