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《第四军医大学》 2010年
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新型Immuno-caspase6对HER2阳性肿瘤细胞杀伤及转位机制的研究

任君琳  
【摘要】: 肿瘤的靶向治疗是近年来研究的热点。效应分子特异地靶向肿瘤并实现高效的杀伤,同时降低对正常组织的损伤,是肿瘤靶向药物发展的方向。作为靶向药物的免疫毒素可以特异的结合于肿瘤细胞表面表达或过表达的受体,并被内化入细胞。毒性片段在细胞内吞后发生转位,在胞浆发挥毒性效应,导致细胞死亡。免疫毒素在应用于血液系统恶性肿瘤和实体瘤的临床试验中取得了很好的疗效,但是由于其毒性片段是外源性蛋白,治疗过程中出现了中和抗体以及剂量依赖性血管渗漏综合征,成为制约其发展的重要因素。 我们前期的研究用人源性促凋亡分子置换免疫毒素中具有毒性效应的外源性毒素蛋白,构建了一系列的免疫促凋亡分子。研究证实免疫促凋亡分子可以特异地靶向HER2阳性的肿瘤细胞,并实现体外体内的高效杀伤。然而,负责转位功能的结构域仍然来源于绿脓杆菌外毒素,并由100多个氨基酸组成,因此机体可能产生针对此片段的免疫反应。为进一步降低免疫促凋亡分子的免疫原性,同时保证免疫促凋亡分子在内吞后能发生有效地转位,寻求新型的转位序列成为我们关注的焦点。 本实验中,我们用优化的绿脓杆菌外毒素的Furin识别序列、白喉毒素的Furin识别序列和寡聚精氨酸置换Immuno-caspase6中全长的PEA转位结构域,构建了三种新型免疫促凋亡分子(e23sFv-FDT/FPE/R9-casp6,统称为新型Immuno-caspase6),通过与不含Furin识别位点(e23sFv-Null-casp6,阴性对照)以及含有全长PEA domainⅡ的Immuno-caspase6(e23sFv-PEⅡ-casp6,阳性对照)的杀伤效果进行比较,来验证新型Immuno-caspase6对HER2阳性肿瘤细胞的杀伤作用。 实验结果显示,新型Immuno-caspase6转染HER2阳性SGC-7901细胞72 h后,作为下游底物的Lamin A被剪切,细胞出现核膜不完整、核固缩等凋亡现象,通过描绘转染细胞的生长曲线,发现HER2阳性细胞生长受到明显抑制,对HER2阴性的HeLa细胞则无明显的影响。含有FDT和R9的Immuno-caspase6具有与阳性对照相似的杀伤效率,而FPE则略低于前三者。我们建立了稳定分泌表达Immuno-caspase6的CHO细胞株,通过超滤浓缩得到分泌表达的目的蛋白。 我们采用目的蛋白与细胞器共定位免疫荧光染色的方法来观察新型Immuno-caspase6在细胞内的转位途径。通过共聚焦显微镜我们观察到,目的蛋白作用6h,含有Furin识别序列的Immuno-caspase6已经发生转位,而没有Furin识别序列的Immuno-caspase6聚集于内吞体或溶酶体,无法到达胞浆。实验结果表明,新型免疫促凋亡分子在内吞体内经Furin识别加工后直接转位进入胞浆,而不是通过高尔基氏体和内质网的反向运输途径。各种识别序列组的转位途径没有差异。我们进一步通过使用质子泵抑制剂Bafilomycin A1和Furin蛋白酶抑制剂Dec-RVKR-CMK证实,免疫促凋亡分子内化入细胞并在内吞体内被Furin蛋白酶识别和加工是免疫促凋亡分子发挥作用的关键步骤。 利用瘤旁肌肉注射脂质体包裹质粒的方法对HER2阳性的SGC-7901胃癌细胞荷瘤裸鼠进行治疗,结果证实,含有FDT、R9的Immuno-caspase6同阳性对照组都具有抑制肿瘤生长、延长荷瘤裸鼠存活期的作用,各组间无明显差异。Immuno-caspase6特异性的分布于肿瘤组织并引起大量肿瘤细胞凋亡,而对重要脏器无明显的毒副作用。 通过比较作用48h后的细胞存活率我们证实了新型Immuno-caspase6对HER2阳性肿瘤细胞比一线抗肿瘤化疗药物Herceptin具有更强的抑制肿瘤细胞增殖的作用。为进一步检测新型Immuno-caspase6是否对Herceptin抵抗的细胞也有杀伤作用,我们建立了Herceptin抵抗的胃癌及乳腺癌细胞株。流式细胞检测表明建株细胞表面的HER2表达明显减低,Immuno-FDT-casp6对Herceptin抵抗的肿瘤细胞仍然有良好的杀伤作用。 相比于我们前期构建的具有PEA全长转位结构域的Immuno-caspase6,含有Furin识别序列的新型Immuno-caspase6具有相似的靶向杀伤活性,但其转位序列从前者的100多个氨基酸残基缩短至9-10个氨基酸残基,因而具有更低的免疫原性,有利于临床的长期反复使用。更为重要的是,我们的实验证实了这种新型的Immuno-caspase6对Herceptin抵抗的肿瘤细胞仍然具有很好的杀伤作用,因而我们认为这种新型的Immuno-caspase6具有更广阔的临床应用前景。 综上所述,新型Immuno-caspase6能够特异性靶向并被内化入HER2阳性肿瘤细胞,在内吞体被Furin切割后直接转位进入胞浆发挥高效杀伤,对Herceptin耐药细胞仍有良好的杀伤作用。我们的研究为HER2阳性肿瘤的治疗提供了新的策略,也为其他肿瘤的靶向杀伤提供了新的治疗思路。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R73-3

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