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《第四军医大学》 2010年
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URG4的表达及其促进胃癌发生发展的相关机制研究

宋久刚  
【摘要】:[背景] 胃癌是严重威胁国人健康的恶性肿瘤之一。目前对于胃癌发生、发展的分子机制并不完全清楚,在一定程度上严重影响了胃癌治疗的发展。胃癌的发生是一个多阶段过程,整个过程中又伴随着遗传和后天基因改变的累积,其中以癌基因和抑癌基因的改变最为重要。对胃癌分子基础的进一步认识有利于胃癌诊断、治疗和预防新策略的建立。参与胃癌发生的有些分子可能成为有用的治疗靶点。URG4(Upregulated gene 4)为我科刘杰教授利用消减杂交及差异PCR技术筛选出的新分子,该基因能明显促进肝癌发生,具有癌基因样作用,可能是一个候选的癌基因。通过生物信息学等方法分析提示URG4可能在胃癌的发生中起着重要作用。迄今为止,URG4在胃癌发生发展中的作用及机制尚未见报道。为此,在前期工作基础上,我们开展了URG4基因在胃癌中作用的相关研究。 [目的] 探讨URG4在胃癌发生发展中的作用及其分子机制,以期更全面的开发新基因的功能,阐明胃癌发生发展的机制,并为寻找新的胃癌治疗策略提供理论依据。 [方法] 1、通过免疫组化方法检测URG4及PCNA在胃癌组织及癌旁组织中的表达分布,并分析其表达的意义及相关性。2、利用RT-PCR和Western blot检测URG4在胃癌细胞系(SGC7901、MKN28、MKN45、AGS和BGC823)以及永生化胃粘膜细胞GES中的表达。3、通过脂质体法将URG4基因的真核表达载体转入GES细胞、将URG4特异siRNA载体转染入胃癌MKN28和SGC7901细胞中,G418筛选抗性细胞克隆。4、利用RT-PCR和Western blot鉴定和检测URG4在转染细胞系及亲本对照细胞中的表达。5、通过MTT法绘制转染细胞及其对照细胞的生长曲线。6、通过流式细胞仪分析转染细胞及其对照细胞的细胞周期分布。7、平板克隆形成实验检测转染细胞及对照细胞的克隆形成能力。8、软琼脂克隆形成实验和裸鼠体内成瘤实验检测抑制URG4表达后,胃癌细胞体内外成瘤能力的变化。9、Western blot检测转染细胞和对照细胞中细胞周期相关分子CyclinD1的变化。10、通过URG4诱导NIH3T3细胞转化实验检测URG4对NIH3T3细胞生物学特性的影响。 [结] 1、URG4在胃癌组织中表达的阳性率是65%,显著高于癌旁组织(30%,P0.001),并且URG4在高分化和中分化胃癌组织中的表达较低分化胃癌组织明显增高(P均0.01);高表达URG4的胃癌组织中PCNA指数是64.04±11.56,而低表达URG4的胃癌组织为49.84±9.68(P0.001)。2、成功构建了URG4正义表达载体和siRNA载体URG4-siRNA1、2、3,测序结果显示序列正确。3、脂质体法将载体转染细胞,G418筛选出稳定转染细胞系GES-pcDNA3-URG4、MKN28-siRNA1,2,3和SGC7901-siRNA1,2,3;Western blot结果显示GES-pcDNA3-URG4细胞较对照GES-pcDNA3细胞URG4表达明显增高,而MKN28-siRNA1,2,3、和SGC7901-siRNA1,2,3细胞分别较空载体对照MKN28-pSilencer、SGC7901-pSilencer细胞URG4表达明显降低;其中以URG4-siRNA2抑制URG4表达的效果最为明显。4、GES-pcDNA3-URG4细胞较GES-pcDNA3细胞生长速度明显加快(P0.05),而MKN28-siRNA1,2,3、和SGC7901-siRNA1,2,3细胞分别较空载体对照MKN28-pSilencer、SGC7901-pSilencer细胞生长速度明显受到抑制(P0.05)。5、GES-pcDNA3-URG4由G1期进入S期的比例为49.6%,较GES-pcDNA3细胞23.5%明显增多(P0.01),而MKN28-siRNA1,2,3进入S期的比例分别为20.6%、18.9%、17.9%较MKN28-pSilencer细胞35.8%明显减少(P0.01),SGC7901-siRNA1,2,3进入S期的比例为23.5%、19.3%、24.2%,较SGC7901-pSilencer细胞44.9%明显减少(P0.01)。6、MKN28-siRNA2细胞在平板内形成克隆数(40.7±4.0个),较MKN28-pSilencer细胞(89.3±9.1个)明显减少(P0.01),SGC7901-siRNA2细胞在平板内形成克隆数为38.7±4.1个,较SGC7901-pSilencer 114.0±7.9个明显减少(P0.01)。7、MKN28-siRNA1,2,3细胞在软琼脂上生长并分别形成集落数为7.5±1.81、4.25±1.89、6.5±2.51个,较MKN28-pSilencer细胞21.5±3.41个明显减少(P0.01)、SGC7901-siRNA1,2,3细胞在软琼脂上生长并分别形成集落数为12±1.63、6±1.12、7.75±1.26个,较SGC7901-pSilencer细胞27.25±2.06个明显减少(P0.01)。8、MKN28-siRNA2和SGC7901-siRNA2细胞在裸鼠体内形成肿瘤的平均体积分别显著小于MKN28-pSilencer和SGC7901-pSilencer细胞形成肿瘤的平均体积(P均0.05)。9、Cyclin D1在URG4过表达的GES-pcDNA3-URG4细胞中表达高于对照GES–pcDNA3细胞;而通过URG4-siRNAs下调MKN28和SGC7901细胞中URG4表达后, Cyclin D1表达亦被下调,以URG4-siRNA2效果最为明显。10、URG4基因能够促进NIH3T3细胞生长和加快细胞周期,但不能使转染后的NIH3T3细胞在软琼脂内或裸鼠体内成瘤。 [结论] 1、URG4在胃癌组织和对应癌旁组织中表达存在显著差异,提示URG4可能参与了胃癌的发生。2、URG4通过促进胃癌细胞生长、细胞周期、增强胃癌细胞成瘤能力等生物学特性促进胃癌的发生发展,具有癌基因样作用。3、URG4可能主要通过调节CyclinD1的表达来发挥作用。4、URG4基因能够使NIH3T3细胞生长显著加快,但尚不能完全使NIH3T3细胞发生恶性转化。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R735.2

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