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《第四军医大学》 2010年
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CD147在类风湿关节炎中性粒细胞中的表达及作用研究

王聪华  
【摘要】: 【目的】 类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以滑膜增殖和骨质破坏为主要特征的慢性炎性疾病。目前认为成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synovial cell, FLS)在空间占位的同时,也可以通过分泌大量的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)达到破坏软骨的目的。在RA关节腔内存在大量的炎细胞,其中滑液中含量最丰富的细胞是中性粒细胞,它的代谢产物水平可以作为反映病情活动度的指标之一。CD147分子,是一种分子量约在57 KD左右的跨膜糖蛋白,因其在促进MMPs分泌中具有重要意义,也被称为胞外基质金属蛋白酶诱导剂(extracellular matrix metalloproteinase inducer, EMMPRIN)。本实验室前期发现在RA滑膜细胞表面CD147分子高表达,促进其MMPs的分泌和活化,同时增强侵袭能力。但是,在细胞与细胞间相互作用中如何促进MMPs分泌增加的机制尚不清楚。为了观察CD147分子在中性粒细胞表面的表达水平及其功能,我们进行了以下研究。 【方法】 采用FACS流式细胞仪分析细胞表面CD147表达阳性率及平均荧光强度(mean fluorescence intensity, MFI),Cell Quest软件进行数据分析。采用实时-定量PCR技术测定MMP-1,-2,-3,-9和CD147的mRNA表达量,MxPro QPCR软件进行数据分析。利用改良的48孔Boyden小室进行趋化实验,亲环素A(cyclophilin A, CyPA)做趋化剂,同时在细胞中加入抗CD147单抗观察其阻断效果。采用明胶酶谱法检测细胞培养基中MMP-2和MMP-9的表达及活化情况。采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)测定MMP-1和MMP-3的表达量。细胞侵袭实验使用Boyden小室进行。采用激光共聚焦扫描显微镜测定HL-60细胞中游离Ca2+浓度,粘附实验检测细胞与胞外基质的粘附能力,并用western blot方法检测脂筏中TRPM-7的表达变化情况。上述实验均重复至少3次。采用Graphpad软件进行数据分析,P0.05认为有统计学差异。 【结果】 1.CD147在RA滑膜细胞表面阳性表达率高于骨关节炎(osteoarthritis, OA)滑膜细胞对照组。HL-60细胞经诱导分化后CD147表达的MFI量显著增加。自RA外周血中分离的中性粒细胞CD147表达的MFI量较自健康对照者外周血中分离的中性粒细胞表达高。自RA滑液中分离的中性粒细胞CD147表达的MFI量较自RA外周血中分离的中性粒细胞显著增高。 2.RA滑膜细胞中MMP-1,-2,-3,-9和CD147的mRNA表达量较OA对照组显著增加,与HL-60细胞共培养后增加明显。HL-60细胞经诱导分化后MMP-1,-2,-3,-9和CD147的mRNA表达量均较诱导分化前增加。 3.由CyPA介导的趋化作用在诱导分化后HL-60细胞中较诱导分化前增加明显。在加入抗CD147抗体组中趋化数目降低明显。 4.明胶酶谱和ELISA结果均显示RA FLS中MMPs的表达量较OA FLS对照组显著增加。诱导分化后的HL-60细胞较诱导分化前显著增加。RA FLS与诱导分化后的HL-60细胞共培养后的MMPs表达量较与诱导分化前共培养组显著增加。经抗CD147抗体作用后,MMPs表达量显著降低,无关抗体对照组则无显著变化。 5.明胶酶谱和ELISA结果显示RA FLS与RA外周血中性粒细胞或健康对照者外周血中性粒细胞共培养后,MMPs表达量均较RA FLS单独培养组显著增加;且与RA外周血中性粒细胞共培养组增加更明显。加入抗CD147单抗后MMPs表达量降低明显,无关单抗组中无此现象。 6.RA FLS与RA滑液中性粒细胞共培养后MMPs表达量较RA FLS单独培养组或其与RA外周血中性粒细胞共培养组增加,加入CD147单抗后MMPs表达量显著降低,无关单抗组则无此作用。 7.侵袭实验证实RA FLS侵袭数目较OA FLS对照组显著增加,与诱导分化后HL-60共培养后侵袭数目较诱导分化前显著增加,且均较RA FLS单独培养组增加明显。RA FLS与RA外周血中性粒细胞共培养后较与健康对照者外周血中性粒细胞共培养组相比,侵袭数目显著增加。RA FLS与RA滑液中性粒细胞共培养后较与RA外周血中性粒细胞共培养组相比,侵袭数目显著增加。加入CD147单抗后侵袭数目显著降低,无关单抗组则无此作用。 8.胞内钙离子测定及粘附实验表明经CyPA刺激后,胞内Ca2+浓度及细胞粘附能力显著增加,加入CD147单抗后这种作用被阻断,Western blot结果提示可能与脂筏层中TRPM-7蛋白发挥功能有关。 【结论】 1.本研究发现CD147表达量在HL-60细胞诱导分化后显著增加。明胶酶谱及ELISA检测显示分化成熟后的HL-60细胞MMPs表达量显著增加。在细胞分化过程中检测到的CD147高表达与MMPs高表达相关,由此导致的MMPs及其抑制因子之间的失衡可能导致了RA的关节破坏。 2.为了观察细胞间相互作用在MMPs产生及RA FLS侵袭中的作用,我们将RA FLS与HL-60细胞进行了共培养。明胶酶谱和ELISA实验均证实RA FLS经与HL-60细胞共培养后,较各自单独培养组MMPs表达量显著增加。细胞侵袭实验也证实高表达CD147的中性粒细胞可能通过与RA FLS相互作用在RA发病中发挥重要作用。 3.为了模拟RA患者体内最真实情况,我们自RA外周血及滑液中分离了中性粒细胞,与RA FLS进行共培养。结果与RA FLS及HL-60细胞共培养体系有类似的趋势,提示在体内高表达的CD147发挥了促进MMPs产生的作用,同时可以增强RA FLS的侵袭能力。4.CD147单抗可以显著抑制MMPs的产生及RA FLS的侵袭能力,提示阻断CD147后,MMPs的产生及RA FLS的侵袭能力均被抑制。 5.趋化实验证实CyPA对中性粒细胞有显著的趋化作用,这种趋化作用可以被CD147单抗所阻断,提示CyPA可能作为CD147的配体在高表达CD147的炎细胞募集过程中发挥作用。 6.CD147分子可能通过TRPM-7蛋白参与了由CyPA诱导的胞内钙离子浓度升高,增强中性粒细胞与细胞外基质的粘附,CD147抗体可将其阻断。 7.总之,我们的研究发现了在RA中性粒细胞高表达的CD147分子可能与CyPA介导的中性粒细胞趋化,RA FLS的MMPs分泌及其侵袭能力有关,上述功能均与RA软骨侵袭及骨质破坏密切相关。通过CD147单抗阻断其作用可能是RA新型治疗策略中的一个潜在靶点。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R593.22

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