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《第四军医大学》 2010年
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孕激素受体在人牙周膜细胞中的表达及孕酮对细胞增殖和成骨分化影响的研究

原工杰  
【摘要】: 绝经后骨质疏松症(osteoporosis, OP)是老年妇女的常见病,多发病。雌孕激素的缺乏被认为是绝经后骨质疏松的主要原因,而骨质疏松被认为是牙周病及牙齿缺失的原因之一。临床研究显示,牙槽骨高度及骨密度的降低与雌激素水平的降低有关。与雌激素相似,孕激素的水平在妇女绝经后也显著下降。孕酮具有重要的骨保护作用,以往的研究多集中于孕酮对全身骨骼系统的影响,而关于孕酮在牙槽骨改建中的作用及机制的研究甚少。 牙周膜(periodontal ligament cells,PDL)是牙骨质和牙槽骨之间的非矿化结缔组织。牙周膜能维持骨形成和骨吸收的平衡,在维持牙周组织内环境稳定中起重要的作用。因此,牙周膜是牙齿萌出和正畸牙移动的基础。人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,hPDLCs)来源于中胚层,它被认为是成骨细胞的来源且具有多向分化潜能。 孕酮是骨代谢的调节因子,它对牙周组组织也产生潜在的影响。孕酮水平的失衡也常常导致牙周疾病的发生。但hPDLCs是否表达孕激素受体(Progesterone receptor, PR),孕酮是否能影响hPDLCs的增殖及成骨分化仍不清楚。本实验主要是从基因和蛋白水平检测PR的表达,研究孕酮在hPDLCs增殖及成骨分化过程中的作用,进而为探讨孕激素及PR在牙槽骨吸收与改建中的作用机理奠定基础。 我们设计了如下实验: 1.人牙周膜细胞中孕激素受体的表达 取正畸拔除的健康前磨牙的牙周膜组织,进行hPDLCs的原代培养,用免疫细胞化学的方法检测PR蛋白的表达,RT-PCR的方法检测PR mRNA的表达。 2.孕酮对人牙周膜细胞增殖能力的影响 用含有不同浓度(1,10,100 nM)孕酮的培养液培养hPDLCs 1,2,3,4,5,6,7天,采用MTT的方法检测在孕酮作用下hPDLCs生长曲线的变化情况。用100 nM孕酮培养液培养hPDLCs3天,以流式细胞周期分析的方法检测孕酮作用下细胞周期的变化。分别以未作处理的hPDLCs作为空白对照组,特异性的PR拮抗剂RU486(100 nM)处理的hPDLCs为抑制剂组。 3.孕酮对人牙周膜细胞成骨作用的影响 我们研究了普通培养液和成骨诱导培养液中孕酮作用于细胞后碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)染色及茜素红染色钙化结节面积的变化。为了进一步研究孕酮在hPDLCs成骨分化中的作用,我们用孕酮干预hPDLCs,检测细胞ALP活性,检测骨涎蛋白(Bone sialoprotein ,BSP)、骨钙素(Osteocalcin,OCN)及骨桥蛋白(Osteopontin, OPN)的含量,研究孕酮及PR对hPDLCs成骨分化能力的影响。 4.雌孕激素联合对人牙周膜细胞增殖分化的影响 用雌二醇,孕酮及雌孕激素联合干预细胞。用MTT的方法检测雌孕激素对hPDLCs增殖的影响,用ALP活性分析和茜素红染色的方法检测雌孕激素对细胞成骨分化作用的影响。 5.孕酮对人牙周膜细胞c-fos、c-jun和Runx2基因表达的影响 用孕酮及抑制剂刺激hPDLCs,检测孕酮对细胞c-fos、c-jun和Runx2基因表达的影响。 研究结果发现: 1、免疫细胞化学结果显示,PR在hPDLCs的胞质和胞核中均有表达,且在胞核的表达明显高于胞质。RT-PCR结果显示hPDLCs中有PRmRNA的表达。 2、孕酮干预hPDLCs后,细胞的增殖高于对照组,PR抑制剂能明显抑制hPDLCs的生长。流式细胞周期分析结果显示:与对照组相比,孕酮组S+G2M期的百分比显著增加。抑制剂组的S+G2M期的百分比低于孕酮组,有显著差异。 3、在普通培养液中,孕酮组的ALP染色阳性面积和茜素红染色钙化结节面积明显高于对照组和抑制剂组。在成骨诱导液中,孕酮同样有促进成骨的作用。与成骨诱导组相比,诱导孕酮组的ALP染色阳性面积和茜素红染色钙化结节面积进一步增加。孕酮干预细胞后,hPDLCs中的ALP活性,BSP,OCN和OPN mRNA的表达升高具有时间及剂量依赖性,抑制剂组各指标减小。 4、在MTT分析中,对照组的hPDLCs增殖明显低于孕酮组、雌二醇组和雌孕联合组。但孕酮组、雌二醇组和雌孕联合组之间没有显著差异。茜素红染色结果显示,雌二醇组钙化结节面积高于孕酮组的钙化结节面积,两者的面积明显低于雌孕联合组。诱导雌孕组的钙化结节面积高于诱导孕酮组和诱导雌二醇组。雌孕联合组的ALP活性明显高于孕酮组和雌二醇组。 5、孕酮组c-fos、c-jun和Runx2 mRNA的表达明显高于对照组,而抑制剂组c-fos、c-jun和Runx2的表达显著降低。 得出了如下结论: 1、免疫细胞化学法和RT-PCR分别从蛋白水平和mRNA水平证实了PR在hPDLCs中有表达。 2、孕酮能够促进hPDLCs的增殖,孕激素受体拮抗剂能有效抑制hPDLCs的增殖。 3、孕酮能够促进hPDLCs的成骨分化,孕酮的作用能被孕激素受体抑制剂所拮抗。提示在hPDLCs的增殖和成骨分化中,孕酮是通过配体-受体途径来发挥其生物学效应的。 4、与空白对照组相比,孕酮、雌二醇及雌孕联合应用均能促进hPDLCs的增殖及成骨分化。雌孕激素联合应用与单独应用相比,对细胞增殖的影响没有显著差异。雌孕激素联合应用比单独应用能够进一步促进细胞的成骨分化。 5、孕酮能够上调hPDLCs中的c-fos、c-jun和Runx2 mRNA的表达。提示孕酮可能通过上调c-fos、c-jun和Runx2的表达促进hPDLCs的增殖和成骨分化,促进骨形成。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R78

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