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《第四军医大学》 2010年
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辛伐他汀对缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡的保护作用及机制

张申伟  
【摘要】: 实验背景及研究目的: 心肌缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury, MI/RI)是指在短时间内由于血栓或冠状动脉痉挛引发心肌血供中断,在一定时间内恢复血供,引起原缺血心肌发生较供血恢复前更严重损伤的现象。心肌细胞(Cardiomyocytes , CMs)在MIRI过程中可发生凋亡,从而对心脏的结构和功能产生重要的影响,因此,如何防治心肌缺血/再灌注损伤,对于保护心肌有着重要的临床意义。 TOLL样受体4(TLR-4)是与病原微生物先天性及获得性免疫系统密切相关的识别分子,TLR4的活化与促炎因子的表达以及不同细胞中信号的活化有关,不仅可介导感染性炎症反应,在非感染性炎症反应中也发挥着重要作用。大多数研究表明:TLR-4基因缺陷小鼠(C3H /HeJ小鼠)与野生型小鼠(C3H/HeN小鼠)相比在MI/RI后的心肌梗死面积明显减少。近来的研究也证实,给予TLR-4特异性抑制剂eritoran阻断TLR-4信号通路后也能够对乳鼠心肌细胞MI/RI损伤起到保护作用。 辛伐他汀(Simvastatin)是从土曲霉素降解产物中半合成的他汀类降脂药物,是目前临床治疗高脂血症的首选药物之一。大量的研究表明,辛伐他汀有独立于降脂之外的抗炎、调节免疫、改善心室重构及抗凋亡的作用,目前对辛伐他汀在心血管疾病尤其在心肌缺血/再灌注损伤中的作用及机制研究较少,本实验旨在建立体外缺氧/复氧细胞模型的基础上,探讨辛伐他汀对缺氧/复氧诱导心肌细胞凋亡的保护作用及TLR-4信号通路的关系。 实验方法 第一部分CMs的培养及缺氧复氧模型的建立:0.125%胰酶无菌分离出生1~3d SD乳鼠心室肌细胞,取2-3代的CMs缺氧2h后,分别复氧4h、8h、12 h及24 h,台盼蓝拒染法检测心肌细胞存活率;LDH试剂盒检测心肌细胞LDH活性;流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率。 第二部分TLR-4信号通路在CMs缺氧复/氧损伤中的变化:取体外培养2-3代的CMs缺氧2h后,分别复氧4h、8h、12 h及24 h,分组加入TLR-4中和性抗体MTS510。处理后收集细胞培养液,并裂解细胞,提取CMs蛋白。Western-blot方法检测各组细胞TLR-4蛋白表达水平。 第三部分抑制TLR-4信号通路对CMs缺氧复氧损伤的保护作用:取体外培养2-3代的CMs,分别给予TLR-4中和性抗体MTS510及/或辛伐他汀(0.1μmol/L,1μmol/L,10μmol/L)预处理,然后给予H/R处理(缺氧2h后复氧4h),LDH试剂盒检测LDH活性;流式细胞仪检测心肌细胞凋亡、Western-blot方法检测细胞TLR-4蛋白表达水平。 实验结果 1、体外成功分离并培养大鼠乳鼠CMs。 2、与正常对照组相比,经过H/R损伤后,各组CMs的LDH活性均明显增加(P0.05),细胞凋亡率增加(P0.05)。 3、与正常对照组相比,TLR-4蛋白的水平在复氧后4h、8h、12 h、24 h明显升高(P0.05)。 4、CMs在通过特异性中和性抗体阻断TLR-4信号通路后缺氧2h复氧4h,与单纯H/R处理组相比,LDH活性明显下降(P0.05),细胞凋亡率下降(P0.05);缺氧前1h给予辛伐他汀(0.1μmol/L,1μmol/L,10μmol/L)预处理后,细胞LDH活性进一步明显下降(P0.05);细胞凋亡率也进一步下降(P0.05)。 结论: 1、H/R损伤可以导致CMs活性下降,LDH活性增加,心肌细胞凋亡增加。 2、H/R可导致心肌细胞TLR-4信号通路激活,,从而诱导心肌细胞凋亡。 3、TLR-4信号通路特异性中和抗体心肌细胞,可减少H/R诱导的CMs凋亡。 4、缺氧前1h给予辛伐他汀(0.1μmol/L,1μmol/L,10μmol/L)预处理后,细胞LDH活性及细胞凋亡率明显下降,提示辛伐他汀具有TLR-4信号通路阻断剂相似的心肌保护作用。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R965

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