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可溶性人PD-1蛋白对肝癌患者树突状细胞功能的影响

李江斌  
【摘要】: 原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是一种严重威胁人类健康和生命安全的恶性肿瘤,为全球常见肿瘤的第5位,其死亡率居恶性肿瘤的第3位[1],我国肝癌死亡率在城市仅次于肺癌,在农村则次于胃癌,其发病率逐年增高,每年全球HCC死亡率高达50多万人,而新发病人数则达到60多万人,其中约50%发生于我国[2]。肝癌恶性程度高、预后差、病死率高,多数患者在经确诊时,已属于中晚期[3],由于患者的肝功差,且多伴有转移,仅10%-20%的患者可行姑息性手术切除,切术后5年生存率仅为25%-50%。因此,新的能够有效抑制肝癌细胞生长的方法将是目前研究的关键。随着对肿瘤免疫学的深入研究,证明了机体对肿瘤存在特异性免疫反应,这为肿瘤治疗指明了新方向,使免疫疗法成为肿瘤治疗的重要手段之一,其中以DC瘤苗为基础的生物免疫治疗成为近年来人们研究的热点,目前部分DC瘤苗已进入Ⅰ、Ⅱ期临床试验[4]。树突状细胞(DC)作为目前已知的专职且功能最为强大的抗原递呈细胞(APC),参与抗原的捕捉、加工、处理和递呈,是淋巴细胞活化、增生、发挥效应的始动环节,主要参与细胞免疫和T细胞依赖的体液免疫,在抗肿瘤免疫应答中起关键作用[5]。体外和动物实验表明,以适当形式的肿瘤抗原负载DC制备瘤苗,可激活能够识别、杀伤肿瘤细胞的特异性T细胞,并可产生免疫记忆效应。大量的临床试验研究也表明DC瘤苗抗肿瘤免疫治疗具有良好的应用前景[6]。在人体的抗肿瘤免疫机制中,T细胞介导的细胞免疫为主要方式。初始T细胞的活化需要两个信号,即由T细胞抗原受体(TCR)与DC上的抗原肽-MHC分子复合物结合提供的抗原特异性信号,又需要DC上的B7共刺激分子与T细胞上的CD28分子结合提供的共刺激信号[7]。只有双信号共同刺激才能有效激活T细胞反应,若缺乏第二信号刺激,将使T细胞处于克隆无能或无应答状态[8],因此B7/CD28共刺激信号对T细胞的活化起着至关重要的作用。近年来,PD-L1/PD-1作为B7/CD28协同刺激分子超家族的一个重要成员,其作用已被越来越多人重视[9]。PD-L1作为B7家族的一个新成员,主要表达于造血细胞,如静息的T细胞、B细胞、单核细胞、树突状细胞[10],其受体PD-1主要表达在活化的T细胞、B细胞、髓系细胞和胸腺细胞[11]。DC上的PD-L1与其受体结合后,可产生抑制信号,并诱导抗原特异性T细胞凋亡、无反应性和衰竭,对机体的免疫应答起负性调控作用[12]。基础研究表明,肿瘤微环境中存在的VEGF、IL-10、TGF-β等细胞因子可诱导树突状细胞PD-L1表达上调,使得肿瘤患者的DC成熟和功能障碍,激活T淋巴细胞能力降低,不能产生有效的抗肿瘤免疫反应,使肿瘤细胞发生免疫逃逸[13]。研究发现,PD-L1是参与肿瘤免疫逃逸过程的一个重要分子,因此封闭PD-L1/PD-1信号传导通路已成为肿瘤免疫治疗的一个重要策略。 目的:本实验观察了应用shPD-1蛋白封闭PD-L1/PD-1信号传导通路,对肝癌患者DC刺激自体T淋巴细胞增殖、分泌细胞因子和刺激CTL杀伤能力的影响,进而探讨通过阻断负性调节信号PD-L1/PD-1来增强肝癌患者DC的免疫刺激能力,为DC瘤苗在临床中的应用提供新的思路。 方法:以Ficoll密度梯度离心法从肿瘤患者外周血中分离出外周血单个核细胞( PBMC)后,再以粘附法获得单核细胞(Mo),应用重组人粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子( rhGM-CSF)、白细胞介素-4( rhIL-4)、α-肿瘤坏死因子(rhTNF-α)体外诱导培养DCs;观察给予或不给予shPD-1蛋白对DC的影响。应用流式细胞术检测DC免疫表型,MTT法检测DC刺激自体T淋巴细胞的增殖能力, ELISA法测定上清液中IL -12p70的水平,MTT法检测效应淋巴细胞对靶细胞的杀伤活性。 结果:封闭DC表面PD-L1分子后,DC刺激T细胞增殖,分泌IL -12p70能力显著提高,促进CTL杀伤反应的能力显著增强(P0.05)。 结论:可溶性人PD-1蛋白(shPD-1)封闭DC表面PD-L1分子后能显著提高DC活化T细胞的能力,促进DC诱导的抗肿瘤免疫反应。


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