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《第四军医大学》 2010年
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沙门菌OmpD介导的rBCG口服疫苗的制备与鉴定

郭晓雅  
【摘要】: 背景 重组活菌疫苗是以某些减毒或者无毒力的活菌为载体,将病原体的保护性抗原基因插入细菌的基因组或者质粒DNA中并使之高效表达的一种新型疫苗。重组卡介苗(Recombinant Bacillus Calmette-Guerin,rBCG)就是重组活菌疫苗中具有代表性的新型疫苗。它是以BCG为工程菌,借助分子生物学技术对其进行基因改造,利用其活疫苗特性,在机体内表达各种疾病的相关抗原,从而达到预防和治疗多种疾病的目的。本研究小组曾成功将屋尘螨抗原Der p2基因转入BCG中表达,制备出抗原Der p2-rBCG。经静脉和腹腔注射接种后,在小鼠体内诱导了Der p2特异性的Th1优势应答。因此我们推测可以通过抗原rBCG疫苗来治疗对某些特定抗原过敏的疾病。 目前分枝杆菌几乎全部是以皮下注射的方式接种。但是研究发现,如果短期内重复皮下注射接种rBCG会引起局部严重的迟发性变态反应(DTH),因此我们考虑采用口服途径接种rBCG。而且,我们前期的研究发现给小鼠口服Der p2-rBCG,同样可以诱导抗原特异性的Th1应答[1, 2]。然而,BCG分枝杆菌并不是肠道定植菌,与肠黏膜的亲和力低,大量口服还会引起肠道正常菌群失调及口咽部感染,从而影响免疫效果。文献回顾发现,沙门菌外膜蛋白Omp D介导了沙门菌与肠黏膜上皮的黏附,因此我们设想此外膜蛋白能够介导rBCG与肠道黏膜的高亲和力结合,从而制备出具有肠道高亲和力的rBCG口服疫苗。 目的 利用分子生物学及基因工程技术,构建能以串联和并联形式、在细菌表面表达Der p2和Omp D抗原的两种rBCG口服疫苗,为体外实验和临床应用提供基础。 实验方法和结果 1. Omp D蛋白的表达及纯化 以鼠伤寒沙门菌Salmonella typhimurium基因组为模板,通过PCR来扩增Omp D基因,与pMD-18T克隆载体连接后测序,结果与Genbank公布的Omp D基因序列完全一致。将Omp D基因克隆入原核表达载体pET-28a(+),经PCR和酶切鉴定后,阳性质粒命名为pET28a(+)-Omp D,并经IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析证实成功表达了与预期分子量一致的Omp D蛋白。Western-blot证实该蛋白可与抗6×His-mAb发生特异性反应。可溶性分析显示该蛋白以包涵体形式存在于沉淀中,经Ni+-NTA亲和色谱法纯化获得了目的蛋白,且纯度达90%以上。 2.兔Omp D多克隆抗体的制备及鉴定 重组蛋白经变性、复性后,按100μg/kg的纯化蛋白加等量弗氏完全佐剂(FCA)乳化后接种于兔颈背部皮内,间隔2w后再进行第二、三次免疫;第三次免疫结束2w后以等量重组蛋白追加免疫1次,1w后收集血液,分离血清后ELISA检测特异性抗体效价达到1:10 000以上。Western-blot检测表明,该抗体能与Omp D蛋白发生特异性结合,其特异性与敏感性均较好。 3.两种rBCG口服疫苗的构建与鉴定 为了获得Der p2-Omp D融合基因,我们重新设计引物,经PCR法分别扩增获得新的Der p2和Omp D基因,测序正确后将两者克隆入原核表达载体pProEX HTb,获得pProEX HTb-Der p2-Omp D质粒。①串联表达:将Der p2-Omp D融合基因亚克隆入穿梭胞壁表达载体pCW,经酶切鉴定阳性命名为pCW-Der p2-Omp D质粒。将此重组质粒电穿导入BCG感受态细胞,构建可胞壁串联表达Der p2-Omp D融合蛋白的rBCG;②并联表达:构建pCW-Der p2与pCW-Omp D两种质粒,并将二者同时电穿导入BCG感受态细胞,以构建胞壁并联表达Der p2和Omp D蛋白的rBCG。经潮霉素抗性筛选的阳性克隆,均采用以下三种方式进行鉴定:PCR特异性扩增目的基因片段;用兔抗Der p2多克隆抗体与兔抗Omp D多克隆抗体对阳性克隆分别进行斑点免疫杂交法和间接免疫荧光法鉴定。证实两种rBCG口服疫苗构建成功,并能与特异性抗体发生反应。 结论 1.在E.coli表达系统中成功表达并纯化出Omp D蛋白。该蛋白能够与6×His-mAb发生特异性反应,免疫新西兰兔后获得Omp D多克隆抗体,通过ELISA检测抗体效价达到1:10 000以上。该抗体能与Omp D蛋白发生特异性结合,其特异性与敏感性均较好。 2.采用基因工程手段制备出以胞壁形式串联和并联表达Der p2和Omp D蛋白的两种rBCG口服疫苗,并通过PCR、斑点免疫杂交法及间接免疫荧光法分别进行鉴定。证实了两种rBCG口服疫苗构建成功。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R392

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【参考文献】
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