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中国蓝舌病毒S10、L2基因序列分析及S10基因克隆表达

张以芳  
【摘要】: 蓝舌病病毒(Bluetongue disease virus,BTV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae) 环状病毒属(Orbivirus)的成员,是引起反刍动物蓝舌病的病原。 本研究首次对我国BTV疫苗株进行序列分析,并与野毒株(自然分离毒 株)比较,建立了S10和L2基因系统发育进化树,经对S10基因编码NS3蛋 白的二级结构和三级结构预测分析,进一步揭示了我国BTV的遗传背景。同 时对BTV群特异性和型特异性RT-PCR鉴定方法,及NS3蛋白的克隆表达进 行了研究。其主要内容和结果为: 1、对25株中国BTV各血清型(其中1株疫苗株)及1株南非BTV-1型毒株 S10基因进行RT-PCR扩增和核苷酸序列分析,并与Genbank中8株美国、1 株澳大利亚及7株中国BTV毒株相应序列,共42株蓝舌病毒S10基因序列 分析比较,构建了毒株间遗传关系的系统进化树。 S10基因系统发生树分析,将BTV分为China group和US group二大基 因群,两大群的同源性为85%。US group包括8株美国及1株南非BTV毒株; China group包括32株中国及1株澳大利亚毒株。China group进一步分为China Ⅰ Subgroup和China Ⅱ Subgroup两个亚群,两亚群的同源性为95%。蓝舌病 毒S10基因分群及生态分布说明BTV毒株存在地域分布特征性。 中国BTV-1型S10基因系统发生分析,将21株中国BTV-1型毒株分为 二组,其中疫苗株VacF45为第一组,VacF17鸡胚驯化株及19株野毒株为第 二组。表明野毒株与鸡胚驯化毒或疫苗培育毒由于病毒宿主培养环境改变而导 致S10基因构型改变。 S10核苷酸序列同源性比较,中国BTV毒株间,核苷酸同源性100--86.4% (核苷酸差异0--107个,其中云南V440与湖北V530毒株差异最大);编码 的NS3蛋白氨基酸同源性100--95.6%(氨基酸差异0--10个,其中四川V658 与湖北V530毒株差异最大)。中国BTV毒株S10基因长度均为822bp,核苷 酸链中有两个起始密码子(核苷酸20-22和59-61)和一个终止子TGA或TAA (核苷酸707-709),预测编码两种蛋白(NS3和NS3A),NS3长度229个氨 基酸,NS3A起始于NS3蛋白的第14个氨基酸,长度为216个氨基酸。。 NS3蛋白的一级结构分析,各BTV毒株NS3多肽链中强碱性氨基酸28-32 个,强酸性氨基酸24-25个,疏水性氨基酸79-82个,极性氨基酸56-60个, 等电点为8.706-9.415。 NS3跨膜蛋白的二级结构预测分析,各毒株NS3蛋白的拓扑结构或α-螺 中文摘要 旋结构基本相同。多肽链N-末端和C-末端均位于细胞内,在质膜外的部份为 139-163位氨基酸。跨膜螺旋的数目为2个,长度为14-30个氨基酸,2个跨 膜螺旋间的空间可能是病毒粒子逐出的部位。预测NS3蛋白有3种三维结构。 2、对 15株中国 BTV上型毒株 LZ基因部分区域“54-1806hp)进行克隆和序 列测序,并与 Genbank中 1株澳大利亚及 1株中国毒株相应序列,共 17株 B’I’’Vd 型毒株LZ基因序列进行系统进化分析; LZ系统进化分析将中国BTV上型毒株分为两个组,中国分离年代最早的 Y863毒株门)为第一组,疫苗株 VacF45及 1996年以后分离的野毒株为 第二组,两组之间的同源性是 gi.6%,说明中国 BTV4型野毒株的 LZ基因在 自然进化过程中发生了遗传变异。第二组又分为4个谱系,疫苗株VacF45(由 原始株在鸡胚驯化F45代获得)与原始株V658分别属于第二组的第一和第三 谱系,核昔酸同源性98.6%(核昔酸差异10个X氨基酸同源性98.8%(氨基 酸差异3个;说明BTV原始株在鸡胚传代驯化过程中,其LZ基因也发生了 遗传变异。 3、根据蓝舌病毒510和LZ核昔酸序列设计合成的引物,建立的群特异性和型 特异盯-eR鉴定方法,对我国地方毒株进行群、型鉴定;结果表明潞异性RT-peR 方法能覆盖目前我国已知的BTV血清型,与相关病毒无交叉反应;rV型型特 异RT干CR方法对本型有专一性。用于检验临诊样品和组织样品中盯V感染,具 有比常规方法快速、敏感、特异的优点,可作为临诊和进出口动物中BTY病原检 疫推荐方法。 4、将编码NS3蛋白的* 基因片段克隆至表达载体质粒pET3a中,构建 重组质粒pETns3,将pETns3转入受体菌BLZImE3),在IPTG的诱导下, 可高效表达目的基因,,S-PAGE检测,表达的NS3目的蛋白产物分于量大 /J’ 23.7KD,存在于重组菌株 BLZI(DE3)细胞内,Western blotting检测表明 所表达的NS3蛋白是BTV特异性的,为BTV诊断抗原研制奠定了基础。


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