抗α毒素单链抗体的基因克隆和表达及其生物学特性研究

赵宝华  

【摘要】： 本研究应用RT-PCR技术，从两株分泌具有中和活性的抗A型 产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞株2E3和 1A8中，分别扩增出抗体V_H和V_L基因，用linker（Gly_4Ser）_3基因， 将V_H和V_L基因连接成单链抗体（ScFv）基因，并将其克隆至 pGEM-T载体中。经核苷酸序列分析证实，V_H和V_L基因及linker 基因拼接正确，ScFv-2E3基因全长为726bp，编码242个氨基酸， V_H基因序列位于linker基因的上游，大小为357bp，编码119个 氨基酸残基；V_L基因序列位于linker基因的下游，含有324bp， 编码108个氨基酸残基；linker基因大小为45bp，编码15个氨基 酸残基（Gly_4Ser）_3；ScFv-1A8基因全长为729bp，编码243个氨基 酸，V_H基因序列位于linker基因的上游，大小为351bp，编码117 个氨基酸残基，V_L基因序列位于linker基因的下游，含有333bp， 编码111个氨基酸残基，linker基因大小为45bp，编码15个氨基 酸残基（Gly_4Ser）_3。经计算机软件分析，V_H和V_L基因均为新发现的 基因序列，符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征。ScFv-2E3 的V_H和V_L基因分别属于鼠免疫球蛋白重链Ⅱ（B）和轻链κⅢ家 簇；而ScFv-1A8的V_H和V_L基因分别属于鼠免疫球蛋白重链Ⅱ（A） 和轻链κⅥ家簇。 将两种抗A型产气荚膜梭菌α毒素ScFv基因ScFv-2E3和 ScFv-1A8分别克隆至表达载体pUC119、pET20b、pET28a和 pHOG21中，构建了重组质粒pUC-2E3和pUC-1A8，pET20b-2E3和 pET20b-1A8，pET28a-2E3和pET28a-1A8以及pHOG-2E3和 pHOG-lA8，然后分别转化至受体菌JM105、BL21（DE3）和XL1- BLUE中，得到重组菌株JM105（pUC-2E3）和JM105（pUC-1A8）、 BL21（DE3）（pET20b-2E3），BL21（DE3）（pET20b-1A8），BL21（DE3） （pET28a-2E3），BL21（DE3）（pET28a-1A8），XL1-BLUE（pHOG-2E3）和 XL1-BLUE（pHOG-1A8）。ELISA检测表明：经IPTG诱导后所表达 的目的蛋白存在于重组菌株JM105（pUC-2E3）和JM105（pUC-1A8） 及XL1-BLUE（pHOG-2E3）和XL1-BLUE（pHOG-1A8）的菌培养上 清中，在重组菌株BL21（DE3）（pET20b-2E3）和BL21（DE3）（pET20b- 1A8）以及XL1-BLUE（pHOG-2E3），XL1-BLUE（pHOG-1A8）的胞周 质中也检测到了ScFv的存在。经SDS-PAGE分析表明，蛋白表达 产物在BL21（DE3）（pET28a-1A8），BL21（DE3）（pET28a-2E3）和XL1- BLUE（pHOG-2E3）中均形成了包涵体的形式，而且在重组菌株 XLI－BLUE（pHOG－2E3人XLI－BLUE（pHOG－IAS）的胞周质中出现了 特异的蛋白带。经薄层扫描分析：重组菌株XL IBLUE（pHOG－ 2E3＊XLI－BLUE（pHOG－IAS人BLZI（DE3）（pET20b－2E3）禾 BLZI （DE3）（pET20b AS）的蛋白表达产物分别占菌体可溶性蛋白的 4％、3％、0．9％和 0．7％，重组菌株 XLIBLUE切HOG上E3）的蛋白 表达产物占菌体总蛋白的相对含量为22％，其相对分子量约为 31 KD。 对ScFv的生物学特性研究表明：ScFv蛋白不但具有中和卵磷 脂酶的活性，而且还能够对致死性腹腔攻击的小鼠产生良好的被动 保护作用。

【关键词】：A型产气荚膜梭菌α毒素 单链抗体 克隆 表达 生物学特性
【学位授予单位】：中国人民解放军军需大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2001
【分类号】：S852.43;Q785;Q786
【DOI】：CNKI:CDMD:1.2001.010295
【目录】：

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