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《中国人民解放军军需大学》 2001年
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端粒重复扩增程序(TRAP)的改进和应用以及端粒酶酶学性质研究

吴东林  
【摘要】: 端粒酶(Telomerase)是一种核糖核蛋白,它能利用自身的RNA组分 作为模板,催化合成端粒重复序列(脊椎动物为5’—GGTTAG—3’)。研究 表明端粒酶的表达与细胞永生化及肿瘤发生密切相关,因此对端粒酶活性 的检测日益受到重视。目前应用最广的检测端粒酶活性的方法是Kim等的 端粒重复扩增程序(Telomeric Repeat Amplification Protocol,TRAP)。该方法 引入了PCR扩增步骤,使检测灵敏度大大增加。但由于PCR反应的反向 引物是端粒重复的互补序列,可结合在端粒重复序列的任意部位,导致PCR 产物长度发生变化(变长或变短),不能如实反映端粒酶的持续合成能力(进 行性,processivity),这个缺陷限制了TRAP反应的实际应用效果。针对这 个问题,一些研究者通过在反向引物CX的5’末端加入短的锚定序列的方 法阻止PCR产物错误延长,但未解决PCR产物缩短的问题。利用重新设 计的反向引物和特殊的反应体系,对TRAP方法进行了重大改进,解决了 上述问题,实现了对端粒酶活性的准确测定。利用这个方法,对各种细胞 系,肿瘤临床样品的端粒酶活性进行了测定。并对端粒酶的酶学性质进行 了研究。 端粒重复扩增程序(TRAP)的改进 重新设计TRAP反应引物P1和P2。其中P2引物包括两部分,分别为 端粒序列结合部分和锚定部分,反向引物的重新设计是本实验的关键改进 之一。改进反应体系,引物使用经过重新设计的P1和P2。在体系中只有 dATP、dTTP、dGTP三种核苷酸,不含dCTP核苷酸。端粒酶延伸反应后 进行接尾反应,反应体系中的Taq聚合酶以P2的锚定部分为模板,在端粒 酶产物末端催化合成锚定的“尾”序列。此步反应也可与延伸反应同时进 行。反应液90℃加热3min灭活端粒酶,在此期间加入dCTP。然后进行PCR 扩增。利用人工合成的端粒酶产物作为模板进行TRAP反应,表明改进反 应能正确进行PCR扩增,达到了设计目的。 端粒重复扩增程序(TRAP)的条件优化 对改进的TRAP反应进行优化,确定PCR扩增条件:94℃30s,64℃45s, 72℃1min,27~30个循环。确定反应的最适pH为8.3,最适Mg离子浓度 为1.5mM。检测了方法的灵敏度,人工合成模板R5含量在0.002~0.2amol 中文摘要 一 之间呈线性关系。检测了 293细胞的端粒酶活性,来自 10个细胞的抽提物 可检测到活性,且细胞数在30~1000之间呈线性关系。 不同细胞系与肿鹰样品端粒醇活性测定 测定了40例肿瘤细胞的端粒酶活性,其中37例阳性,3例阴性,阳 .性率·92.5%。人的心、肺、胃、肾等正常组织未见端粒酶活性,人体胎盘 组织有端粒酶活性。肿瘤细胞系293、Hela细胞、SMMC、HepZ、MCF7 均可见端粒酶活性。并初步总结了端粒酶活性与肿瘤样本病理指标间的关 系。 端粒酶活性和端粒酶催化亚基表达的相关性 通过RT—PCR检测hTERT基因的表达,肿瘤样品有特异扩增产物。 发现肿瘤样品端粒酶活性与端粒酶催化亚基表达之间有一致性。但端粒酶 活性大小与催化亚基表达强度之间没有正相关关系。说明除催化亚基决定 端粒酶活性外,细胞中的其他因素对端粒酶活性也有较大影响。 端粒酶酶学性质研究 利用改进的lLAP方法对端粒酶的酶学性质进行了研究,发现不同种 类的脱氧核苔酸对端粒酶活性的影响不同,考察了端粒酶的底物专一性; 证明人的端粒酶对端粒序列有一定的核酸酶活性。
【学位授予单位】:中国人民解放军军需大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:Q55

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