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《中国人民解放军军需大学》 2002年
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应用噬菌体展示技术进行猪瘟病毒结构(糖)蛋白E2和E~(rns)中和抗原表位鉴定和比较

张富强  
【摘要】: 猪瘟病毒(CSFV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和边界病病毒(BDV)为黄病毒科瘟病毒属成员,其病毒结构、抗原性和遗传特性密切相关。CSFV囊膜结构(糖)蛋白E2(gp55)是诱导机体产生中和抗体及激发保护性免疫应答的主要抗原蛋白。蛋白结构模型预测其N-末端区域暴露于病毒粒子表面,而C-末端短肽区延伸并穿越病毒囊膜。囊膜结构(糖)蛋白E~(rns)/EO(gp48)具有RNA酶活性,在病毒增殖及中和病毒感染中发挥重要作用,是诱导机体产生保护性免疫应答的第二抗原蛋白。E2和E~(ns)与细胞表面受体的相互作用介导猪瘟病毒对细胞的感染过程。 免疫过氧化物酶染色试验检测135株瘟病毒分离物结果表明:抗CSFV囊膜结构(糖)蛋白E2的单克隆抗体c24/10、a18、WH303及M1669,能识别目前已知的所有猪瘟毒株。而针对E~(ns)的单克隆抗体1B5,b4-22和24/16均仅能识别部分猪瘟毒株,提示其对应的表位在所有猪瘟毒株不是共有的。上述所有单克隆抗体对CSFV感染均具有中和作用,与反刍动物瘟病毒不存在交叉反应。 本研究应用CSFV E2或E~(ns)单克隆抗体c24/10、a18、WH303、M1669或1B5,b4-22 24/16,通过筛选M13噬菌体展示的12肽随机多肽文库,进行CSFV囊膜结构(糖)蛋白E2和E~(ns)抗原表(拟)位定位;应用ELISA、阻断ELISA、免疫印迹分析、抗体中和活性抑制试验及免疫荧光抑制试验,鉴别不同表(拟)位对单克隆抗体的免疫反应性差异,对构成表位的关键性氨基酸残基进行鉴定;进行c24/10,a18,b4-22,24/16单克隆抗体轻链可变区编码基因核酸序列分析比较。结果发现: 1、c24/10、a18、WH303单克隆抗体针对同一在所有CSFV分离毒株中高度保守,而在其它瘟病毒(BVDV及BDV)相应区域差异显著的线性抗原表位。表位基序精确定位于E2结构蛋白的832-837位氨基酸(SPTTLR)(丝氨酸-脯氨酸-苏氨酸-苏氨酸-亮氨酸-精氨酸)。在此表位的氨基酸残基中,第一、二、三、五位氨基酸残基是与c24\10,a18单抗隆抗体结合的必需氨基酸,也是构成此抗原表位的关键性氨基酸;尤其是第三位苏氨酸,当其改变为丝氨酸后,丧失与c24\10,a18单抗隆抗体的结合能力,但仍可被WH303单克隆 抗体识别;第六位精氨酸对表位与单克隆抗体的高亲合性结合有关。 2、鉴定获得WH303单克隆抗体识别的2个主要拟位:IfNnrT、 AxIFPMTA及单抗M1669识别 3个主要拟位DxW、SLMPP、MLLH, 并经ELISA和兔疫印迹检测获得证实,但在病毒EZ蛋白分子的氨基酸序列 中未发现相同或相似的氨基酸序列。 3、研究发现分别针对IBS,b4-22和24/16单克隆抗体的三个主要抗原表 (拟)位基序以山b八 DKNR ( G和 A (T CxlteKN,分别定位于E”结 构蛋白的351——357位、384-386位及322-323位、380-386位氨基酸。b4-22和 24/16单克隆抗体针对的抗原表位基序有部分公共序列KN,识别E”‘蛋白中 的相同 门以)抗原区,但其侧翼序列及在免疫印迹分析结果存在显著差异。 b422单克隆抗体针对的是构象型表位。初步阐明IBS、24/16单克隆抗体抑 制CSFV Em蛋白的RNA酶活性的作用机制。 4、单克隆抗体中和活性抑制试验表明:携带SPTxLR表位基序的噬菌 体能特异性抑制单克隆抗体C24/10和WH303对病毒感染的中和活性,而 IFhpr T、sIWVATA基序且不能。 5、单克隆抗体免疫荧光抑制试验发现:携带SPD九九FrNrR DKN ( GorA (T CxyxKN表(拟)基序的噬菌体在免疫荧光试验中能阻断或部 分阻断C24八,fos,b4E2和24人 单克隆抗体与病毒蛋白的结合反应。 6、自c24门,als,b4E2,24门 单抗杂交瘤细胞中获得鼠格G轻链可变区 编码基因并进行序列分析比较表明:b422,24/16单克隆抗体对应的轻链可 变区编码基因的核苦酸及氨基酸序列均存在差异,同源性分别为79%和 63%,轻链上的三个互补决定区(CDR)或超变区氨基酸序列均存在显著差 异;c24/10,a18单克隆抗体在轻链可变区编码基因氨基酸序列中,有6个 氨基酸存在差异,其中5个氨基酸差异位于轻链可变区内的CDR区,CDRI 存在四个氨基酸差异,CDRZ存在一个氨基酸差异,而CDR3完全相同。
【学位授予单位】:中国人民解放军军需大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:S852.65

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