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《中国人民解放军军需大学》 2002年
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FMLP刺激的HL-60中[Ca~(2+)]i和某些激酶对NADPH氧化酶激活和肌动蛋白聚合的作用

崔玉东  
【摘要】: 趋化肽N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰苯丙氨酸(fMLP)能够诱导中性粒细胞发生多种生物学反应,包括NADPH氧化酶催化的过氧化物生成、游走、肌动蛋白聚合等。fMLP与中性粒细胞表面G蛋白偶联受体结合后,迅速引起磷脂酶C(PLC)激活,进而引起胞浆Ca~(2+)浓度升高和激活蛋白激酶C(PKC)。PKC使NADPH氧化酶胞浆成分p47~(phox)发生磷酸化,并引起p47~(phox)和其它胞浆成分转位到胞浆膜上,与氧化酶膜成分一起形成完整的、有活性的NADPH氧化酶,产生过氧化物。在PKC激活的同时,磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-K)也被激活,PI3-K进一步引起蛋白激酶B(PKB,或称Akt)激活,据研究认为Akt能够激活NADPH氧化酶,而且PI3-K还能够参与中性粒细胞的趋化作用。另外,有证据表明有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族的p38 MAPK和胞外信号调节激酶(ERK)也可能调节NADPH氧化酶激活和参与趋化作用。但是有关胞浆Ca~(2+)和PKC、p38 MAPK、ERK、PI3-K激酶在NADPH氧化酶激活和肌动蛋白聚合方面的作用以及有关胞浆Ca~(2+)和这些激酶参与NADPH氧化酶激活和肌动蛋白聚合的信号转导途径仍不清楚。 本研究应用胞浆Ca~(2+)螯合剂和PKC、p38MAPK、ERK、PI3-K激酶抑制物研究了在中性粒细胞样HL-60细胞中这些信号分子对NADPH氧化酶激活和肌动蛋白聚合的作用及某些相互关系,也研究了Ca~(2+)螯合剂、PKC和PI3-K对fMLP诱导Akt激活的作用。为进一步了解和认识NADPH氧化酶激活和肌动蛋白聚合机理及其信号转导途径、以便临床上更好地防治炎症及炎症性疾病奠定理论基础。 首先,为确定胞浆Ca~(2+)和这些激酶在NADPH氧化酶激活过程中的作用,使用不同剂量的Ca~(2+)螯合剂BAPTA-AM、PKC抑制剂GF109203x、p38 MAPK抑制剂SB203580、ERK抑制剂PD098059和PI3-K抑制剂wortmannin处理细胞,然后检测了对过氧化物生成的影响。结果10μmol/L BAPTA-AM和8μmol/L GF109293x均明显地抑制过氧化物产生;50μ mol/L SB203580和50μ mol/LPD098059分别抑制50%和 60%过氧化物生成;0.1μmol/Lwortmannin仅抑制30%过氧化物生成。为了解O_2~-产生过程中PKC、p38MAPK、ERK和PI3-K激酶对胞浆Ca~(2+)变化是否有调节 作用,用激酶抑制剂处理细胞后检测了这几种激酶受到抑制时对 utn刺激的胞浆cap变化的影响,结果这些激酶对胞浆cah浓 度变化没有明显影响。为澄清胞浆 CaZ\ PKC和*-K对 p38 MAPK、ERK和Akt激活的调节作用,用Ca‘”螫合剂和PKC、PI3* 抑制剂处理细胞后检测mLP诱导的 p3 8 MAPK、ERK和 Akt激酶 活性,结果证实Ca卜、PKC和PI3-K对p38 MAPK激活均有一定 的调节作用;而ERK和Akt主要受PI3-K调节。这些结果表明在 fMLP诱导的HL60细胞中,胞浆Ca入”KC依赖性途径对NADPH 氧化酶激活起着重要作用,而PI3-K依赖性途径包括ERK和Akt 仅起到部分作用;这些激酶激活不影响n付*P诱导的胞浆*/”变 化;ERK和 Akt主要受到 P13l调节,而p38 MAPK则受到胞浆 C/”、PKC和N3.K共同调节而参与NADPH氧化酶激活。 为了进一步了解 p3 8 MAPK激活 NADPH氧化酶的机理,用 抑制物 SB203580研究了在分化的 HL巧0细胞内 p38 MAPK对 fMLP诱导的 p47…叶磷酸化和转位到胞浆膜上的作用。结果发现 p38 MAPK激活的动力学与NADPH氧化酶激活动力学一致,50 u mol/L SB203580有够完全抑制 p38 MAPK激活,并能明显抑制 p38 MAPK对 n47”‘”“体夕磷酸化和 n47”‘””转位至胞浆膜上。这些 结果说明在 uLP刺激的分化为中性粒细胞样的 HL60细胞中 P3 8, v&vx可能通过磷酸化p#/加”和影响p4v则转位到胞膜一k而参与 NADPH氧化酶激活。 肌动蛋白聚合和解聚是中性粒细胞发生趋化作用和运动性的 关键。为了解胞浆 Ca卜和 PKC、p3 8 MAPK、ERK、PI3*这几 种信号分子对肌动蛋白聚合的调节作用,用胞浆 ca》螫合剂和这 些激酶抑制物处理分化的HL-60 细胞,然后用流式细胞仪检测 fMLP刺激的肌动蛋白聚合。结果 0.in mol/L wortmannin明显地 抑制了 fMLP诱导的肌动蛋白聚合,而 10 u mol/L BAPTA.AM、8 u mol/L GF109293x、50 u mol/L SB203580和 50 u mol/L PD098059 对fML诱导的肌动蛋白聚合均无明显影响。这些结果表明肌动蛋 白聚合受到 PI3-K调节,而不受胞浆 Ca》和 PKC、p38 MAPK、ERK 调节,而且PI3-K调节的肌动蛋白聚合信号转导途径不同于PI3。K 调节 ERK和 P3 8 MAPK激活的信号转导途径。
【学位授予单位】:中国人民解放军军需大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:Q55

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