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《中国人民解放军军需大学》 2002年
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层粘连蛋白α_5 LG1-3、LG2、LG3的cDNA克隆、表达及LG1-3蛋白多克隆抗体的制备

展德文  
【摘要】: 层粘连蛋白是哺乳动物细胞基质中一种主要糖蛋白,是基质的主要功能成分,也是胚胎发育中出现 最早的细胞外基质的成分。它在控制细胞的增殖、参与细胞的迁移,控制细胞分化,促进创伤修复方面起着传递信号的作用。层粘连蛋白与Ⅳ型胶原蛋白结合形成三维精细结构,赋予组织以韧性、弹性、保水性及对机械力的缓冲性,并为细胞提供生存及从事活动的微环境。层粘连蛋白是由α,β和γ构成的三聚体。α_5在成年组织中广泛表达,在胚胎发育过程中,α_5发挥着重要作用。 本实验采用RT-PCR技术,应用高保真DNA聚合酶从小鼠心脏,肾等中扩增出LG1-3,LG-2,LG3三个基因片段,经琼脂糖凝胶电泳,在接近1.6KB,0.5KB,0.5Kb处出现特异片段,并将其连入pMD18-T载体中,转入JM109细胞中,提取质粒,采用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切鉴定,获得了1.6KB,0.5KB,0.5Kb的片段,将鉴定理想的质粒进行测序,获得正确结果。 将克隆载体上LG1-3,LG-2,LG3三个基因片段用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切,回收酶切产物,同时将原核表达载体pET-28a也用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,回收酶切产物,将回收的酶切产物进行连接,并转入JM109感受态细胞内,培养12-18小时后,挑取阳性菌落,提取质粒,进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定,证明该cDNA已经成功连入原核表达载体pET-28a中。用IPTG诱导阳性菌,经12%SDS-PAGE电泳分析,三个基因片段均获得了表达,表达形式为包涵体。 纯化基因片段LG1-3所表达的包涵体蛋白,皮下多点注射实验用家兔,连续免疫4次,每次间隔2周,期间用ELISA跟踪检测抗体效价。8周后,心脏采血,获得高效价的抗血清。
【学位授予单位】:中国人民解放军军需大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:Q78

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