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《中国人民解放军军需大学》 2003年
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短芒大麦盐胁迫相关基因的克隆及其功能分析

陆一鸣  
【摘要】: 由土壤盐碱化而导致的盐胁迫是抑制植物生长、降低农作物产量的主要环境因素,严重影响着现代农业的发展。研究植物耐盐分子机理和培育耐盐新品种,对开发和利用盐碱地具有重要意义。短芒大麦[Hordeum brevisubulatum (Trin.) Link]是一种优良的牧草,其营养价值、产量都较高,具有良好的生产性能及较高的经济价值。本研究是在已对短芒大麦的生理生化特性、耐盐突变体等方面进行了大量研究的基础上,进行了短芒大麦耐盐分子机理的初步探索,这将为进一步培育短芒大麦耐盐新品种,从而开发和利用盐碱地打下基础。 cDNA文库是研究基因的结构、表达和功能的基础。为了研究短芒大麦盐胁迫相关基因及其表达,本研究以λZAP为载体,构建了盐胁迫下短芒大麦cDNA文库,其重组率为96%,滴度为2×10~6pfu/ml,扩增后滴度为1.8×10~(11)pfu/ml,插入片段长度在0.5kb~3kb。 甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因是盐胁迫相关基因之一。根据BADH的同源性设计引物,RT-PCR获得613bp的探针HDBL;经同源性比较确定后,地高辛标记,筛选盐胁迫下短芒大麦cDNA文库,获得短芒大麦甜菜碱醛脱氢酶(HDBADH)基因的全长cDNA,共1776bp,读码框位于85~1602bp,编码505氨基酸,5′-UTR为85bp,3′-UTR为174bp,且具有PolyA加尾信号(AATAA),GenBank Accession Number为AY188952。氨基酸同源性分析,发现与大麦的BADH同源性高达95.4%;SMART分析其蛋白质结构域,发现含有一个典型的aldedh结构域。Southern杂交检测发现在短芒大麦基因组中有2个拷贝;Northern杂交检测表明短芒大麦HDBADH受盐诱导表达,在2%NaCl盐胁迫下,短芒大麦叶片中的BADH表达量增加了3~4倍。利用表达载体pBin438构建了短芒大麦HDBADH基因的植物表达载体PHDBL,并进行了初步的转基因番茄研究,PCR检测获得5株转基因番茄植株,且能在含100mmol/L NaCl的培养基上生根、生长。 mRNA差异显示技术能快速有效地研究同一类细胞在不同生理状态下或不同生长发育阶段的基因表达差异。本研究应用荧光mRNA差异显示技术,分析盐胁迫及非盐胁迫(正常条件)短芒大麦叶片之间的差异,共获得96个差异片段,其中91个片段有再扩增产物,再扩增率为94.79%。差异片段克隆、测序和反向Northern杂交检测后,有75个片段有杂交信号,阳性率为82.43%;经BLAST、DNAsis软件包分析,共获得32个与盐胁迫相关的cDNA序列,并全部呈送GenBank,获得GenBank Accession Number;其差异cDNA类型分别为:诱导表达型,22个;增强表达型,7个;抑制表达型,3个。同源性分析结果表明,其中13个cDNA与已知基因序列有 号 【 一定的同源性,19个 cDNA为未知 ESTs。 以 DDRT-PCR方法获得的诱导表达型 HDLZ cDNA片段为基础,利用 5’RACE 技术获得一全长CDNA,共852hp,读码框架位于67~570hp之间,编码167氨基酸, 5’·UTR为66hp,3’-UTR为283hp,且具有POlyM)加尾信号(TGTAAA);氨 基酸同源性分析,发现与类似网格组合蛋白 AP19*lathrin assembly protein AP191ike protein)有较高的同源性;PROSITE数据库分析 HDLZ的结构位点,发现含有 Clathrin adaPtor comPlexes small chain signature([LIVMC]-ILIW]-Y-[KRI-X(4)-L·Y-F): sMART分析其蛋白质结构域,发现含有一个典型的clatydaptofj结构域。因此认为 短芒大麦HDLZ是类似网格组合蛋白 AP19基因(clathrin assembly protein AP19Jke Protein),推测其在细胞器高尔基体中发挥着重要的作用,可能与液泡膜的形成有关。
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