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鸡端粒相关序列克隆与定位及MDV特异序列定位MD宿主细胞的研究

汉丽梅  
【摘要】: 马立克氏病(Marek's Disease, MD)是鸡的一种淋巴组织增生性病毒性肿瘤病,是由高感染性的细胞结合性α-疱疹病毒—马立克氏病毒(Harek's Disease Virus, MDV)血清Ⅰ型(MDV serotypel, MDV1)引起。 近年来对MD的研究进展很快,主要是由于两个原因,其一是MD对养鸡业的世界范围的巨大危害,50-60年代起,随着养禽业的集约化,MD在全世界范围内广泛流行,给养禽业造成重大经济损失。其二是MDV在病毒性肿瘤发生和疫苗预防恶性肿瘤研究领域的重要地位,因为MDV是第一个能用实验证明的具有致肿瘤作用的疱疹病毒;并是世界上第一个也是到目前为止唯一可用疫苗成功预防的病毒性肿瘤病。深入研究MDV及其致MD肿瘤的发生机制,在比较医学上具有广泛的生物学意义。 MD淋巴瘤的研究进展主要在相互作用的两个方面——宿主细胞和病毒,近年来,人们对MD研究主要集中于病毒方面,包括病毒的血清型、病史、免疫学、致瘤方面等有大量的研究报道,但对MD淋巴瘤形成的机理及MD形成与宿主细胞端粒、端粒酶活性改变的关系报道很少。 端粒是真核生物染色体末端的特殊结构,在染色体完整性的保持、定位和复制中发挥重要作用。基于端粒酶在大多数正常的体细胞中无活性,而在大多数人的肿瘤细胞中具有活性的发现,建立了癌症与衰老的端粒-端粒酶假说。有材料表明,在肿瘤细胞持续生长的过程中,都有端粒酶活性升高,这就提示我们,端粒酶活性的上调或重新激活或许可作为肿瘤发生的重要判断指标。在MDV诱导形成的肿瘤细胞系中,MDV主要是以整合形式存在于宿主细胞,并且主要是整合在大或中染色体的端粒部位,但也可发生在小染色体上,而端粒又是整合的好发部位。这些资料都提示我们应该从MDV作用的宿主细胞着手,特别是宿主细胞染色体末端的基因结构。 本研究从MDV作用的宿主细胞基因组,特别是端粒及端粒相关序列的研究入手,以MD肿瘤为模型,研究了MDV整合宿主细胞染色体类型及位置与端粒及端粒相关序列的关系,从而进一步探讨病毒性肿瘤的发生机制。 克隆了鸡的两段端粒相关序列(Telomere-associated sequences, TAS)TAS1 和 TASZ。同源性分析结果表明,鸡的 TASI和 TASZ与 MI)V基因组的末端重复序列 TRL、TRS和内部重复序列IRL与IRS的交汇处存在的a -r序列的同源性很高, TASI和TASZ与oV的a ---r序列同源性分别达76.2%和93.7%,而它们与鼠的TAS 同源性却很低,分别为50.9%和52.3%:但鸡的TAS之间的同源性却很低,见别、 TASZ与CSYTELO三段鸡的TAS之间的同源性分别为63.1%,59.1%,52.8%,从而可以 推断,鸡的端粒相关序列具有很高的多态性:同时,MI)肿瘤的发生可能与宿主细 胞端粒结构密切相关。 首次应用染色体荧光原位杂交(FISH)技术,定位了鸡的两段端粒相关序列所 存在的染色体类型及位置,主要是大中染色体单侧游离末端,这与整合型MI)V存在 于宿主淋巴瘤细胞系的位点很一致,从而可以推断,鸡的端粒附近可能是MI)V极好 的整合位点。根据实验需要,优化了鸡活体染色体标本制备技术条件及FISH实验 技术条件,为进一步研究打下基础。 应用FISH实验技术,以oV特异序列为探针,研究了人工感染y诱发形成 的MD肿瘤模型,r特异序列定位MI)宿主细胞基因组情况。结果表明,oV #合 宿主细胞染色体位点主要位于大中染色体的端粒区,个别位于小染色体上,并且在 每个单个细胞,MI)V整合染色体位点是不同的,从而可以推断,MI:)V整合宿主细胞 基因组可能和端粒及端粒相关序列有关,这种整合可能是研究o肿瘤发生机制的。 很重要的方向,同时预示肿瘤的形成可能是单克隆的。 应用改进的TRAP法,测定了人工感染MDV诱发鸡MD形成的肿瘤模型,血清端 粒酶活性,并同期测定了血清总SOD活性和MDA含量的变化。结果表明,血清端粒 酶在临床症状和剖检的可视症状出现前就被激活,相关性分析表明,实验组血清端 粒酶活性、总SOD活性和MDA含量三者在m发病进程中的变化有一定的相关性, 虽然只有血清端粒酶活性和总SOD活性变化之间呈显著正相关,其它各指标间相关 不显著,但血清端粒酶活性、总SOD活性变化和宿主细胞转化形成肿瘤的关系仍值 得关注。


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