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《中国人民解放军军需大学》 2003年
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IE180不同缺失突变体对真核细胞基因表达调控作用研究

赵凤云  
【摘要】: 目前临床上70%的糖蛋白类药物是由哺乳动物细胞表达的,因为只有哺乳动物细胞才有完整的糖基化功能。在基因表达过程中,常常会遇到表达量低或者不表达的情况,真核转录激活因子会大大提高基因表达产物的产率。经分析伪狂犬病病毒立即早期蛋白(immediate-early protein180, IE180)的蛋白质结构,发现IE180具有转录激活因子的结构特征,能与Ⅱ类RNA聚合酶结合,IE180基因缺失突变体对SV40及CMV启动子调控作用的研究,是考察IE180能否作为转录激活因子应用的关键。 目前国内外没有关于野生型的IE180或其突变体对SV40和CMV启动子调控作用的报导,此研究可为IE180基因缺失突变体,在人的巨噬细胞病毒和猴空泡病毒40控制方面的应用提供理论依据。 另外IE180与HSV的立即早期蛋白ICP4有较大的同源性,研究IE180转录调控作用有利于疱疹病毒转录调控模型的建立。 本试验应用DNAMIS及PROSIS软件分别对GenBank中登记号为No352564的IE180序列进行了蛋白质序列分析,结果表明其1-34段氨基酸序列具有典型Helix-Turn-Helix特征序列,并且富含酸性氨基酸D及E,是典型的DNA识别序列;富含丝氨酸序列的152-409氨基酸序列是一个与激活有关的、潜在的磷酸化位点;454-696氨基酸区域是DNA结合域;64-151氨基酸片段没有明显的序列特征;从中可看出IE180蛋白的1-1080氨基酸段具有典型的转录激活因子结构特征。 为获得较高水平的表达,用PCR方法对IE180基因进行缺失,得到对应GenBank中查得序列1-1079氨基酸序列的核苷酸片段,其克隆质粒命名为pJmP_P_2;用多次PCR方法,在P_1P_2缺失突变体基因片段基础上,进一步缺失掉64-151氨基酸片段对应的核苷酸片段,将其克隆质粒命名为pJmP_1P_3P_2,缺失并克隆了465-1079氨基酸对应的核苷酸片段,其克隆质粒命名为pJmP_6P_2,由于该基因序列发生突变,提前终止了翻译过程,但该片段保留了一个完整的DNA结合域和一个完整的核结合位点。序列分析结果表明上述克隆质粒具有正确的阅读框架,说明本试验成功地对IE180基因进行了缺失突变。 用BamHI和HindⅢ酶酶切克隆质粒和pcDNA3载体质粒,回收P_1P_2、P_1P_3P_2及P_6P_2基因片段及pcDNA3线性质粒,再用T_4DNA连接酶将线性pcDNA3分别与P_1P_2、P_1P_3P_2 及P6PZ基因片段连接,构建三个IE180蛋白的基因缺失突变体的真核表达质粒P。P;P。、 pCPIP3PZ、pCP6PZ。 将真核表达质粒peP;P。、peP;P3P。和peP。P。与报告质粒pCAT3-control共转染HeLa 细胞,在pCAT3-control中含一个SV40真核启动子带动着一个报告基因——绿酶素 乙酸转移酶(chloramphenicol acetyl transferase,CAT),它在哺乳动物细胞中 能表达CAT蛋白。真核表达载体在HeLa细胞中表达不同缺失突变体,这些突变体保 留了IE180不同的结构域,分别具有激活功能和抑制功能,作用于SV40启动子影响 着 CAT的表达。通过 CAT ELISA试剂盒检测 CAT表达量,从而间接检测所构建和表 达的 IE180突变体调节功能。突变体 P;P。(11079 $基酸段),P;P。P。(-63加 152-1079 氨基酸段)对SV40启动子的均有转录激活活性,这表明缺失的氨基酸片段(64-151 氨基酸序列)对转录激活是非必需的。P。P。(465-1079氨基酸段)对SV40启动子明 显的抑制活性,因为它只包含DNA结合域和核结合位点,说明发挥转录抑制功能的 关键是IE180的DNA结合域。 构建以CMV启动子为转录启动于并带有报告基因CAT的真核表达质粒PCAT,将 PCAT质粒与所构建功能质粒PCP;P。、PCP;PsP。、P。P6P。共转染HPLP细胞,结果表明所 有的缺失突变体对CMV启动子都表现抑制活性,我们发现在IE180和p启动子的 转录起始位置两侧同时具有两个特征序列(5’-ATffiT-3’)。这说明不同的IE180突 变体,对于 SV40启动于这类在转录起始位置一侧只有一个“5’-ATCGT-3’”特征蛋 白质结合序列的11类基因启动于,可分别表现出抑制活性与激活性。而对于转录起 始位置两侧同时具有两个蛋白质特征结合序列的启动子则表现抑制活性,这说明 IE180基因缺失突变体的功能的发挥依赖于它所作用的启动子,为IE180蛋白对真核 转录调控机制提供了较为有力的证据。
【学位授予单位】:中国人民解放军军需大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:Q78

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