大豆体细胞胚再生体系的优化与双价抗虫基因的遗传转化

【摘要】： 本文对东北地区主栽大豆东农L13、合丰25等5个品种的体细胞胚再生体系及遗传转化体系进行了优化研究，并应用农杆菌介导法和基因枪法对其进行了双价抗虫基因(Bt和CPTI)的遗传转化。 对大豆体细胞胚的继代增殖、萌发及再生等进行了研究，优化了大豆体细胞胚基因转化受体体系。结果表明，MS培养基附加10-20mg／L2，4-D可以使大豆体细胞胚继代增殖，扩繁系数为3~n(n为继代次数)。体细胞胚形态正常，体细胞胚干燥处理以及高浓度的蔗糖和活性炭均可以提高大豆体细胞胚的萌发率和再生率。 确定了筛选剂卡那霉素的使用浓度，生根以前100mg／L，生根以后降为25mg／L。也确定了抑菌剂头孢霉素的使用浓度，第一次为300mg／L，以后每继代一次，降低100mg／L，直至降为0。 用农杆菌介导法和基因枪法对大豆体细胞胚进行了遗传转化，并利用大豆抗性体细胞胚筛选频率对转化体系的因子进行了优化。结果表明，用农杆菌介导法转化时，用球形体细胞胚受伤处理作为受体、预培养1.5天、菌液浓度以OD_(600)=0.5-0.7、AS浓度为50-100μmol／L、侵染时间10分钟、共培养时间2-3天，有利于转化；用基因枪轰击时，氯化钙浓度2.5mol／L、氦气压力1100Psi、轰击次数为2次，有利于提高转化率。 应用Gus瞬时表达检测对转化以后3-7天的体细胞胚进行检测，表面有蓝点出现，初步证明目的基因已经转入大豆体内。对移栽成活的抗性植株应用PCR检测，用农杆菌介导法共得到5株阳性植株，其中东农L13阳性植株2株，CH21141和合丰25以及Progress各1株，转化率为0.72％，黑农35和东农40没有得到阳性植株；用基因枪法共得到2株阳性植株，转化率为0.50％。初步证明双价抗虫基因Bt和CPTI已经转入大豆体内。PCR-Southern以及斑点杂交分子检测证实了PCR的结果，进一步证明双价抗虫基因Bt和CPTI已经整合进大豆基因组中。