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《中国人民解放军军医进修学院》 2011年
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新型脱细胞骨基质—壳聚糖骨组织工程支架的实验研究

刘昊  
【摘要】:目的本实验利用猪股骨制备新型脱细胞骨基质(acellular bone extracellular matrix,ABECM)材料及脱细胞骨基质-壳聚糖(Chitosan, CS)骨组织工程复合多孔支架,检测其理化性能和生物相容性,探讨其成为骨组织工程支架材料的可行性,为组织工程骨支架的研究提供实验依据。 方法(1)采用Triton X-100和十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)等联合脱细胞方法对猪股骨干进行处理,对ABECM材料进行定性分析。应用溶液共混、冷冻干燥法制备脱细胞骨基质/壳聚糖(ABECM/CS)骨组织工程复合支架,对复合多孔支架进行组织学、免疫组织化学、扫描电镜、孔隙率、力学性能等特性进行检测分析。(2)分离、培养兔骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),传代后将细胞与支架复合共同培养,观察细胞的黏附、生长与增殖情况;采用MTT法观察材料浸提液于1、3、5、7天时进行细胞毒性实验观察细胞的活性;将材料浸提液与稀释血混合离心后观察红细胞溶血情况,检测OD值计算相对溶血率;将材料浸提液经静脉注入兔体内进行热原实验,在规定时间内观察兔体温变化。 结果(1) ABECM材料及ABECM-CS复合支架HE染色、Hoechest33258荧光染色均无细胞残留,甲苯胺兰、蕃红O染色、茜素红染色染色阳性,Ⅰ型胶原、骨形态发生蛋白-2抗体免疫组织化学染色阳性。扫描电镜和Micro-CT显示ABECM-CS支架具有多孔结构,孔径50-200μm,孔隙率为(53.50±4.23)%,力学检测支架在干燥状态下纵向压缩模量为(33.23±14.45)Mpa,支架湿润状态下的压缩模量为(2.27±1.13)Mpa。(2)细胞-支架复合培养试验显示细胞黏附与生长良好,死活细胞染色可见支架上粘附活细胞,支架周围细胞生长活跃细胞伸出伪足相互之间连接,并有基质成分产生。细胞毒性试验显示,培养1、3、5、7天后各时间段内三组OD值两两比较(P0.05),无显著差异,表明材料无毒性。在溶血试验中,观察实验材料的溶血率为3.0%,在生物材料标准值溶血率5%范围内,提示无溶血现象发生。热原实验结果显示每只兔体温升高均低于0.6℃,且3只兔体温升高总度数低于1.4℃,符合热原检测规定,复合材料无致热作用。 结论(1)经联合脱细胞处理得到的ABECM材料与CS溶液共混、冷冻干燥法所制备的ABECM/CS复合多孔支架去细胞彻底,保留了脱细胞骨基质主要成分,具备合适的孔径和孔隙率;(2)ABECM/CS复合支架无细胞毒性、无溶血反应、无热原性,细胞-支架复合培养试验显示细胞生长与黏附良好,具有良好的生物安全性和细胞相容性,可作为构建组织工程骨的支架载体材料。
【学位授予单位】:中国人民解放军军医进修学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R318.08

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