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《中国人民解放军军医进修学院》 2011年
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不同致龋性变形链球菌临床分离株的筛选和鉴定

苏东华  
【摘要】:变形链球菌群(mutans streptococci, MS)是人和动物的主要致龋菌,但从人类口腔中检出的MS主要是变形链球菌(streptococcus mutans,简称变链菌)。变形链球菌的鉴别是研究龋病的基础。本研究从变链菌的分离、纯化入手,以形态学、生物化学、分子生物学等方法进行鉴定,通过体外致龋实验,筛选出了不同致龋性变形链球菌临床分离株,为龋病研究和临床防治提供实验资料。 第一部分不同龋敏感者菌斑中变形链球菌的分离、培养和鉴定 目的:从无龋和高龋人群中分离、鉴定变形链球菌,并进行菌株的基因分型,为下一步研究提供实验菌株。方法:将40名受试者分为两组,其中无龋组(DMFT=0)14人,高龋组(DMFT≥6)26人。对从受试者口腔中采集的菌斑进行细菌分离,初代培养,次代纯化培养。对纯化的变链菌进行形态学鉴定、微量生化管鉴定、API 20 Strep生化试剂盒鉴定和VITEK全自动生化仪的鉴定,并针对变链菌的固有基因:表面蛋白抗原Ⅰ/Ⅱ(SpaP)基因,葡糖基转移酶(GtfB)基因和葡聚糖(DexA)基因,通过聚合酶链式反应分别扩增192bp,517bp和1272bp的DNA片段,根据电泳结果进一步检测变形链球菌菌株的准确性。采用AP-PCR的方法,对得到的变形链球菌临床分离株进行了基因分型。结果:40名受试者参加实验,从其中32人口腔内菌斑中共分离、鉴定得到46株变形链球菌临床分离株。细菌形态学、镜检结果可见变形链球菌典型形态,细菌微量管生化反应、API 20 Strep生化试剂盒及VITEK生化仪鉴定结果准确。46株变链菌菌株进行的基因鉴定时均得到了SpaP基因、GtfB基因和DexA基因相应固有序列的电泳图谱。将46株菌株通过AP-PCR基因分型共得到41株不同基因型的菌株。结论:基因鉴定方法高效、准确,随机引物分型可以得到不同基因型的变形链球菌,为下一步研究提供合适菌株。 第二部分变形链球菌临床分离株体外致龋能力的检测 目的:通过对前期分离、鉴定的变形链球菌临床分离株进行蔗糖依赖粘附能力、产酸能力、耐酸能力及合成胞外多糖能力的检测,旨在筛选出其中的高致龋性菌株和低致龋性菌株,并初步阐述其与不同龋敏感者的关系,为进一步研究龋病的致龋特点和发病机制提供思路。方法:分别对41株不同基因型的变形链球菌临床分离株进行蔗糖粘附能力实验、产酸能力实验、耐酸能力实验及合成胞外多糖能力实验。测量所有菌株这四项致龋能力的数值,并将每项实验数据结果按照由强到弱的顺序排列,按照四项致龋能力均较强者作为高致龋性菌株,反之作为低致龋性菌株的原则,筛选出高致龋性菌株和低致龋性菌株。并结合前期实验组筛选到的不同龋敏感性变形链球菌临床分离株差异ssDNA配基H19,采用流式细胞术,检测筛选出的高,低致龋性菌株与配基H19的结合情况,验证筛选的菌株的准确性。结果:41株变形链球菌临床分离株四项致龋实验数据结果分别列表(数据均按由高到低顺序排列)。根据41株变形链球菌临床分离株致龋实验数据综合分析,四项实验检测能力均较强者作为高致龋性菌株(第12-1、16-2、27-1分离株),反之作为低致龋性菌株(第5-1、8-1、9-1分离株)。流式细胞术结果显示:高致龋性菌株与差异ssDNA配基H19结合后,荧光强度增加程度较低致龋性菌株明显,图形波峰右移也更为明显。结论:流式细胞术结果符合差异ssDNA配基与高,低致龋性菌株结合特点。高致龋性菌株综合致龋能力较强,低致龋性菌株综合致龋能力较弱。体外致龋能力的强弱与患者龋敏感性存在不确定性,值得进一步研究。
【学位授予单位】:中国人民解放军军医进修学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R378

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【参考文献】
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