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LRP16基因对3T3-L1脂肪细胞瘦素表达的影响及其机制研究

张婷婷  
【摘要】:目的: LRP16基因(Leukemia related protein16LRP16)是我们课题组于1999年首先克隆的,定位于染色体11q12.23的基因,其表达产物是一个核蛋白。研究发现LRP16基因特异性的受雌激素受体a (ERa)的调控,ERа通过与LRP16启动子的1/2ERE/Sp1序列结合上调LRP16mRNA的表达。LRP16基因作为ERа调控的靶基因,反馈增强ERа介导的转录激活活性,是ERа的一个共激活因子。近年来相继报道的大型绝经期妇女小剂量雌激素替代治疗研究,发现雌激素替代治疗可以有效降低体重,改善绝经后妇女体脂重新分布的程度。基础研究发现脂肪细胞上表达ERа和ERβ,雌激素主要通过ERa调控脂肪细胞中瘦素的表达。因此,我们提出LRP16作为ERa的靶基因及ERa的共激活因子,可能具有调控脂肪细胞中瘦素表达的功能。本研究通过3T3-L1脂肪细胞建立过表达LRP16基因的稳定细胞系,探讨LRP16基因对脂肪细胞中瘦素表达的影响及其可能的机制。 方法: 1)建立LRP16基因过表达的3T3-L1稳定细胞系将3T3-L1细胞按80%密度接种于6cm培养皿中,24h后按superfect transfection说明书将pcDNA-3.1-16和pcDNA-3.1转染细胞,24h后更换为含800μg/mlG418的DMEM培养基进行抗性筛选3周,以后用含半量400μg/ml G418的DMEM培养基培养细胞,构建LRP16过表达细胞系3T3-L1-16及对照细胞系3T3-L1-3.1。用Western Blot的方法进行验证。 2) LRP16基因对3T3-L1脂肪细胞瘦素表达的影响 a) Western blot检测在3T3-L1脂肪细胞诱导分化中(诱导第0、4、8天)瘦素及LRP16蛋白的表达量变化。 b) Western blot检测在10-5、10-7及10-9mol/L的ERа激动剂PPT及ERа抑制剂MPP作用下3T3-L1脂肪细胞中ERа蛋白表达量。 c) Q-PCR检测3T3-L1-16及3T3-L1-3.1在10-5、10-7及10-9mol/L的ERа激动剂PPT及ERа抑制剂MPP作用下leptin mRNA水平。 d) ELSIA检测3T3-L1-16及3T3-L1-3.1在10-5、10-7、10-9mol/L的ERа激动剂PPT或ERа抑制剂MPP作用24h或48h后细胞上清液中leptin表达量。 e) Western blot检测3T3-L1-16及3T3-L1-3.1在10-5mol/L的ERа激动剂PPT及ERа抑制剂MPP作用24h后leptin表达量。 3) LRP16基因对3T3-L1脂肪细胞瘦素JAK/STAT信号通路的影响 a) LRP16基因对JAK/STAT信号通路的影响: Q-PCR检测3T3-L1-16及3T3-L1-3.1中JAK2mRNA、STAT3mRNA及SOCS3mRNA表达量的差异。Western Blot法检测3T3-L1-16及3T3-L1-3.1中JAK2-STAT3信号通路关键蛋白pJAK2(tyr1007/1008)、pSTAT3(tyr705)表达量的差异。 b)10-5mol/L ERа抑制剂MPP干预24h后,Western blot检测3T3-L1-16及3T3-L1-3.1中pJAK2(tyr1007/1008)、pSTAT3(tyr705)表达的变化。 4) LRP16对瘦素转录活性的影响 a)构建leptin启动子核心区质粒,与pGL3-basic连接为pGL3-lep-(-762)。 b)将pGL3-lep-(762)、ERа真核表达载体、pcDNA-3.1、pcDNA-3.1-16、pRL-TK共转染ERа阳性MCF-7细胞及ERа阴性COS-7细胞及Hela细胞。双荧光素酶报告检测系统检测p (-762)lep-luc相对荧光素酶活性以反映leptin启动子转录活性。ERа抑制剂MPP预干预MCF-7后,共转染上述质粒后,检测MPP对LRP16所调控的瘦素启动子活性的影响 结果: 1)建立LRP16基因过表达的3T3-L1稳定脂肪细胞系SuperFect脂质体转染法分别把质粒pcDNA-3.1-16和空白质粒pcDNA-3.1转入3T3-L1前脂肪细胞中,经G418筛选,获得稳定过表达LRP16的细胞株。通过Western blot检测,过表达LRP16的细胞系(3T3-L1-16)的LRP16表达量约为对照组细胞系(3T3-L1-3.1)的2.37倍(p0.05)。 2) LRP16基因对3T3-L1脂肪细胞瘦素表达的影响 a) Western blot检测3T3-L1脂肪细胞在诱导分化中LRP16及leptin表达的变化:脂肪细胞诱导分化中leptin表达量逐渐增加,第4、第8天leptin蛋白表达量较诱导初具有统计学差异;LRP16表达量也随诱导分化时间延长而增加,第4天、第8天LRP16表达量较诱导初具有统计学差异。 b) Western blot检测PPT(10-5mol/L)作用3T3-L1脂肪细胞ERa表达量较对照组增加(P0.01);相反,MPP作用下3T3-L1脂肪细胞ERa表达量较对照组(p0.01)及低浓度组明显下调。 c) Q-PCR示,3T3-L1-16及3T3-L1-3.1在10-5mol/L的ERа激动剂PPT作用下较空白组leptin mRNA表达无明显增加,10-5、10-7、10-9mol/L ERа抑制剂MPP作用下leptin mRNA表达均较空白组下调,其中10-5、10-7mol/L的MPP下leptin mRNA表达下降具有统计学差异。 d) ELSIA示,10-5、10-7、10-9mol/L ERа激动剂PPT作用24h及48h,两组细胞上清液中leptin蛋白表达均较无PPT作用组上调,其中10-5mol/L的PPT下leptin蛋白表达上调具有统计学差异。PPT作用24h与48h组间无统计学差异。10-5、10-7、10-9mol/L ERа抑制剂MPP作用24h及48h,两组细胞上清液中leptin蛋白表达均较无MPP作用组下调,其中10-5、10-7mol/L的MPP下leptin蛋白表达下降具有统计学差异。MPP作用24h与48h组间无统计学差异。 e) Western blot示,10-5mol/L的PPT及MPP作用24h leptin蛋白表达均较空白对照组增加(或下降),具有统计学差异。 3) LRP16对3T3-L1脂肪细胞JAK/STAT信号通路的影响 a) Q-PCR结果示过表达LRP16基因的3T3-L1-16组JAK2mRNA、STAT3mRNA及SOCS3mRNA表达量分别为对照组3T3-L1-3.1的1.46倍(P0.01)、1.25倍(P0.01)及1.49倍(P0.01)。Western blot示过表达LRP16基因的3T3-L1-16组pJAK2(tyr1007/1008)、pS TAT3表达量分别为对照组3T3-L1-3.1的1.97倍(P0.01)和1.18倍(P0.01)。 b)10-5mol/L的ERа抑制剂MPP作用下,3T3-L1-16组JAK2mRNA、STAT3mRNA及SOCS3mRNA表达量是空白3T3-L1-16组JAK2mRNA的31.4%(P0.01)、57.1%(P0.01)及91.5%。Western blot提示MPP干预后3T3-L1-16组pJAK2(tyr1007/1008)、pS TAT3表达量分别为未干预3T3-L1-16组的48.2%(P0.01)和53.4%(P0.05)。 4) LRP16对瘦素启动子的影响a)构建瘦素启动子(-762bp到+29bp)的荧光素酶报告载体pGL3-lep(-762)。对所需合成的基因全序列进行分析,进行单链oligo的设计及合成;利用PCR将合成的oligo拼接成完整的基因,测序验证得到正确基因片段;目的基因和质粒载体pGL3-Basic进行NheI和HindIII双酶切,T4DNALigase连接构建亚克隆载体pGL3-Basic-Lep(-762)转化至感受态细胞;对转化的亚克隆载体进行测序,得到正确结果。 b)在ERа阳性的MCF-7细胞中LRP16呈剂量依赖性的上调p(-762)lep-luc的转录活性,当pcDNA-3.1-16量为0.5μg时,p(-762)lep-luc的相对荧光素酶活性上调至为对照组的2.63倍(P0.05)。而在ERа阴性的COS-7及Hela细胞中,LRP16未明显上调p(-762)lep-luc的转录活性;共转染ERа后,在COS-7及Hela细胞,LRP16明显上调p(-762)lep-luc的转录活性。当pcDNA-3.1-16量为0.5μg时,p(-762)lep-luc的相对荧光素酶活性升高为对照组的2.6倍(P0.01)及2.7倍(P0.01)。pcDNA-3.1-16质粒量为0.5μg时,MPP干预组p(-762)lep-luc的相对荧光素酶活性为非干预组的41.3%(P0.01)。 结论: 1)成功构建了过表达LRP16细胞系及对照细胞系,为后续实验研究提供了稳定的细胞模型。 2) LRP16基因上调3T3-L1脂肪细胞瘦素表达,ERa抑制剂部分抑制LRP16基因对3T3-L1脂肪细胞瘦素的上调。 3) LRP16基因通过影响JAK/STAT信号通路,从而影响3T3-L1脂肪细胞瘦素主要生理功能。 4) LRP16基因对瘦素具有转录激活作用,部分依赖ERa的调控。 总之,LRP16基因对从转录水平上调脂肪细胞瘦素表达,影响瘦素下游JAK/STST通路。而且LRP16对瘦素的调控部分依赖于ERa的存在。


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