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《中国人民解放军军医进修学院》 2012年
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喉癌干细胞在低氧介导的喉癌放疗抵抗中的作用

王茂鑫  
【摘要】:第一部分低氧微环境加放疗对Hep-2细胞系CD133+细胞的富集作用 目的:观察体外低氧和常氧培养下喉癌Hep-2细胞系在放疗前后CD133+细胞比例及生长抑制率的变化,探讨肿瘤干细胞在低氧介导的喉癌放疗抵抗中的作用。方法:体外常氧和低氧环境下培养人喉癌Hep-2细胞,分别给予不同剂量的射线照射,检测各组细胞放疗后不同时间细胞生长抑制率和CD133+细胞比例的变化。结果:常氧组各个剂量和时间点的生长抑制率均高于低氧组,24小时、10Gy时差异最大,具有显著性(P0.05)。放疗后CD133+细胞低氧和常氧组均有不同程度的富集,低氧组在各个剂量和时间点的CD133+细胞比例均高于常氧组,24小时、10Gy时差异最大,具有显著性(P0.05)。结论:喉癌干细胞在低氧介导的喉癌放疗抵抗中有重要作用,并提示阻断低氧因素可能会增强喉癌的放疗敏感性。 第二部分喉癌干细胞在低氧介导的喉癌放疗抵抗中作用机制 目的:探讨肿瘤干细胞在低氧介导的喉癌放疗抵抗中的作用机制。 方法:体外培养人喉癌Hep-2细胞和HIF-1α沉默的Hep-2细胞,分别用流式细胞仪分选出CD133+细胞,并分别在低氧和常氧条件下行无血清培养,由此分为四组:(1)低氧培养的CD133+细胞为A组;(2)常氧培养的CD133+细胞为B组;(3)低氧培养的HIF-1α沉默的CD133+细胞为C组(4)常氧培养的HIF-1α沉默的CD133+细胞为D组。各组细胞分别给予不同剂量的照射,照射后不同时间行MTT检测。行软琼脂克隆形成实验,并给予10Gy照射,14天后观察四组细胞克隆形成率。四组细胞分别给予10Gy照射,24小时后用流式细胞仪分别检测DNA-PKcs、ATM、Survivin、P53的表达。结果:流式细胞仪分选后获得CD133+细胞纯度是92.8%和94.1%,CD133+细胞B、C、D三组放疗后各个剂量和时间点的生长抑制率均高于A组。放疗前后CD133+细胞克隆形成率均高于CD133-细胞。A组的克隆形成率均明显高于B、C、D组(P0.05)。A组放疗后DNA-PKcs、Survivin表达均较其余三组高(P0.05),而ATM、P53表达无明显差别(P0.05)。结论:喉癌干细胞在低氧介导的喉癌放疗抵抗中有重要作用,其放疗抵抗的机制是通过激活以DNA-PK为主的NHEJ和以ATM为主的HR两种途径来修复损伤的DNA,而低氧导致的喉癌干细胞放疗抵抗能力的增强则主要是通过DNA-PK的活性增强实现的。 第三部分喉癌干细胞对低氧介导的喉癌放疗抵抗作用的动物实验 目的:通过观察喉癌干细胞在裸鼠体内成瘤情况,及放疗后肿瘤内的CD133+细胞比例、各种蛋白表达情况,进一步证实喉癌干细胞在低氧介导的喉癌放疗抵抗中的作用。方法:取HIF-1α沉默和未沉默的CD133+细胞分别注入裸鼠背部皮下成瘤,成瘤后,随机将12只裸鼠分为4组:HIF-1α未沉默放射组(A组),HIF-1α未沉默对照组(Ac组)HIF-1α沉默放射组(B组)、HIF-1α沉默对照组(Bc组),每组3只。2周后A组和B组给予10Gy放疗,Ac组和Bc组给予0Gy。每隔2日测量肿瘤大小,2周后杀鼠取瘤,测肿瘤重量,计算抑瘤率,测CD133+细胞比例,和DNA-PKcs、ATM、P53、Survivin蛋白的表达。结果:CD133+细胞只需4000-10000就能成瘤。放疗后抑瘤率A组较B组低(P0.05);CD133+细胞比例放疗组均大于相应对照组,A组大于B组(P0.05)。DNA-PKcs、ATM、P53、Survivin蛋白的表达放疗组均大于相应对照组(P0.05),DNA-PKcs、Survivin表达A组大于B组(P0.05),而ATM、P53的表达A组和B组无明显差异。结论:CD133+细胞对放疗有抵抗作用,其放疗抵抗的机制是通过激活NHEJ和HR两种途径来修复损伤的DNA,而低氧导致的其抵抗能力的增强则主要是通过DNA-PK的活性增强和干细胞数量增多实现的。
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