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环孢菌素A-纳米乳增强脂肪组织来源干细胞移植治疗小型猪急性心肌梗死疗效研究

尹巧香  
【摘要】:背景:干细胞移植到心脏受心肌梗死后恶劣微环境影响,导致细胞大量凋亡甚至死亡。因此,如何提高干细胞移植成活率就成为干细胞治疗领域最大的挑战。环孢菌素(CsA)是临床广泛应用的高效免疫抑制剂。近年来研究发现,环孢菌素A能抑制细胞凋亡,因而得以在心血管领域应用。然而长期应用环孢菌素A可能带来的肝、肾毒性却限制了该药在临床的大规模应用。借鉴肿瘤化疗药物的靶向递药的成功经验,我们制造并评估了负载环孢菌素A的纳米乳(CsA-NP)。由于纳米微粒能修饰药物在体内的重新分布,因而有望达到靶向、高效、低毒的疗效。 目的:因此,本项研究将评估CsA-NP是否能增强脂肪组织来源干细胞(ASCs)移植治疗小型猪急性心肌梗死疗效及可能机制。 方法:第一部分:CsA-NP采用高压均质法制备而成。采用高效液相色谱法(HPLC)评估产品的载药率,乳径的粒径经激光粒度分析仪测定。 第二部分:评估CsA-NP在体外对ASCs增殖和分化的影响。提取小型猪腹股沟脂肪组织经分离、培养和扩增。ASCs表面标记物经流式细胞仪检测鉴定。ASCs增殖和分化采用细胞直接计数和MTT检测。 第三部分:评估CsA-NP保护ASCs抗凋亡作用及可能机制。采用过氧化氢(H2O2)体外诱导ASCs凋亡模型, Annexin-VFITC/PI双染流式细胞术检测ASCs细胞凋亡,细胞活性和Caspase-3活性检测分别采用CCK-8试剂Caspase-3试剂,cytochrome c的表达采用Western blot分析。 第四部分:延迟增强核磁共振(DE-MRI)评估经皮球囊封堵冠状动脉法制备小型猪急性心肌梗死模型。 第五部分:17头AMI后存活的小型猪分为四组: control组(n=5); CsA-NP组,(n=4); ASCs组(n=4); ASCs和CsA-NP联合移植组(CsA-NP+ASCs组, n=4)。AMI后1周经冠脉内注入ASCs或PBS。干细胞移植前和干细胞移植后8周,DE-MRI评估心脏结构和功能。病理组化评估移植后心肌和移植细胞情况。 结果:第一部分:本研究制备的CsA-NP工艺稳定性好,粒径均匀,50%的乳滴微粒直径在162nm以内。 第二部分:检测结果提示ASCs分子表型CD29、CD44、CD90、CD105均呈阳性表达,而CD31、CD34、CD45、HLA-DR均呈阴性表达。CsA-NP浓度在(0.01-1mg/ml)之间对细胞增殖有明显促进作用(P0.01);其中又以0.5mg/ml的CsA-NP剂量组为最佳。5mg/ml以上对细胞增殖几乎没有影响。 第三部分:细胞形态(细胞皱缩、凋亡小体形成和DNA片段化)和生化结果检测显示H2O2能诱导ASCs凋亡,但CsA-NP(0.1-10mg/ml)作用24小时后能抑制H2O2诱导的ASCs凋亡,其中又以5mg/ml浓度组为最佳(P0.001)。H2O2诱导的ASCs线粒体内跨膜电位坍塌可部分被CsA-NP (0.1-10mg/ml)抑制。CsA-NP(0.1-10mg/ml)可下调caspase-3活性,而且Western-blot结果显示CsA-NP (5mg/ml)可完全抑制H2O2诱导的cytochrome C释放。 第四部分:有17只小型猪心肌梗死造模后存活,成功率54.8%(17/31)。MRI显示心肌梗死面积为10.2±2.9(cm3)。与对照组比较,AMI组CO、LVEF和SV均明显下降(P0.001);而LVEDV和LVESV均升高(P0.05)。DE-MRI与后期的左室短轴病理切片结果相呼应。 第五部分:与对照组比较,ASCs和CsA-NP+ASCs组的LVEDV、 LVESV升高显著(P0.05)。与CsA-NP和ASCs组比较,CsA-NP+ASCs组的LVEF提升尤其明显(P0.01),而梗死面积和室壁厚度下降显著,梗死中心和梗死边缘的血管增生明显(P0.01),而其它三组无显著性差异。与ASCs组比较,CsA-NP+ASCs组DAPI和免疫荧光显示心肌表面标记物α-actin, cTn-T, vWF分化显著增多(P0.01)。Masson纤维染色显示ASCs和CsA-NP+ASCs组的纤维增生显著下降(分别为P0.05, P0.01)。TUNEL显示ASCs和CsA-NP+ASCs组心肌细胞凋亡明显减轻(分别为P0.05, P0.01)。CsA-NP+ASCs和CsA组caspase-3和cytochrome C水平显著下降(P0.05)。 结论:CsA-NP增强了ASCs移植治疗小型猪AMI疗效,改善了左室重构,提高了心功能。心功能的改善与ASCs移植联合CsA-NP应用抑制细胞凋亡,促进细胞增生、分化与存活,刺激心肌组织血管增生有关。


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