重组免疫毒素CTLA4-ScFv-Mel的构建、制备及活性研究

【摘要】：器官移植是治疗终末期器官功能衰竭的有效手段,免疫抑制剂的应用可以减轻移植排斥反应,但化学类免疫抑制剂毒副作用明显,影响了其临床应用。生物制剂类免疫抑制剂尤其是免疫毒素可以通过其特异性的结合作用,清除抗原特异性T细胞,且毒副作用较小,有更好的应用前景。 免疫毒素是具有导向能力的分子(载体)和具有细胞毒性的分子(毒素)偶联而成的具有特异性细胞杀伤能力的杂合分子,在治疗恶性肿瘤、移植排斥等方面有良好的应用前景。 CTLA-4是一种仅表达于活化T细胞而静止T细胞不表达的分子,因此CTLA-4的抗原结合分子是一种理想的免疫毒素导向分子,由之产生的免疫毒素只对活化的T细胞或肿瘤细胞有杀伤作用,避免了对正常静息T细胞的非特异性损伤。 蜂毒肽(Melittin, Mel)是蜜蜂蜂毒的主要成分,是一种重要的抗菌肽,具有抗菌、抗辐射、抗肿瘤等作用。它由26个氨基酸组成,分子量小,免疫原性低,不易产生过敏反应；具有膜活性,直接对细胞的磷脂膜起溶解作用,抑制细胞发育,是一种较理想毒素片段。 本研究以人源化抗CTLA-4单链抗体为靶向片段,特异性结合在表达CTLA-4的活化T细胞表面,以蜂毒肽类似物为毒素片段,特异性杀伤活化T细胞,设计构建出了高效低毒的免疫毒素分子,主要用于抗移植排斥反应。 利用重叠延伸PCR技术,通过两步PCR获得了重组免疫毒素全长基因,将其与表达载体pBV220连接,转化大肠杆菌,重组基因在大肠杆菌表达系统中以包涵体形式表达。包涵体用8M脲变性,采用稀释复性,然后用SP-Sepharose-Fast-Flow阳离子交换柱分离纯化,Sephacryl S-200凝胶排阻层析柱精制,制备得到目的蛋白CTLA4-ScFv-Mel. 在体外活性研究中,2μmo1/L的CTLA4-ScFv-Mel分别作用于非活化的T淋巴细胞、阴性对照细胞ECV-304、ConA激活的T淋巴细胞、CTLA-4阳性细胞Raji知Jurkat细胞。结果显示,给药24h后各组细胞存活率下降,其中前两组细胞的存活率分别为78.9%和77.3%；而后三组分别为31.2%、32.7%和30.8%。说明CTLA4-ScFv-Mel对CTLA-4阳性细胞的杀伤率高于正常细胞,表现出细胞杀伤的选择性和高效率。 体内活性研究以BEL-7402肝癌移植瘤模型和S180小鼠移植瘤模型为对象,分低、中、高三个剂量给药,比较试验组和阴性对照组移植瘤相对体积等药效学指标。结果显示,CTLA4-ScFv-Mel能够发挥促进两个试验组模型中移植瘤的存活和生长的作用,且呈现一定的剂量效应关系。推测该现象的出现与抑制T细胞免疫有关。 本研究成功制备了一种全新的免疫毒素融合蛋白,并进行了初步活性研究和药效学评价,为器官移植提供了潜在的选择药物,具有一定的科学价值和开发前景。