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《中国人民解放军军医进修学院》 2012年
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人脐带间充质干细胞治疗失代偿肝硬化患者的前瞻性对照研究

林沪  
【摘要】:肝硬化在我国为常见肝脏疾病,且发病率逐年升高。临床上一旦合并腹水、肝性脑病或食道胃底静脉曲张破裂出血等并发症,以及血清白蛋白降低、胆碱酯酶活力降低、胆红素与转氨酶升高及凝血酶原时间延长等征象,说明患者已经进入肝硬化失代偿期,若不及时治疗可能最终造成肝功能衰竭。对于失代偿期肝硬化患者,原位肝移植被认为是唯一有效的治疗手段,但因供肝严重不足、费用昂贵、围手术期风险、移植后免疫抑制剂的长期使用及移植肝肝炎等问题,限制了肝移植的广泛开展。 干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的原始细胞。胚胎干细胞虽具有全能性(totipotency),但因伦理问题应用受到限制。成体干细胞具有多能性(multipotency),它包括造血干细胞、神经干细胞、肝干细胞以及间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSCs)等。MSCs主要存在于骨髓、肝脏、脐带、外周血等中胚层间充质,具有独特的免疫调节作用、自我更新和跨胚层多向分化潜能等特点[1]。目前多采用骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived MSCs, BM-MSCs)移植治疗肝硬化已经在国内外研究机构广泛展开[2]。然而迄今为止,BM-MSCs治疗肝病尚缺乏前瞻性对照临床试验以明确其安全性和有效性;并且已经有研究显示,HBV感染患者BM-MSCs分化潜能和免疫抑制功能显著降低。近年来,脐带间充质干细胞(human umbilicalcord-derived mesenchymal stem cells,UC-MSCs)因其取材方便、扩增简便、无伦理学限制和病毒感染风险而备受关注,也已开始应用在临床研究。本课题设计了前瞻性对照研究以观察UC-MSCs治疗失代偿性肝硬化患者的安全性和有效性。 本课题采集健康脐带组织,采用胰酶、胶原酶顺序消化法分离单个细胞,通过贴壁培养分离纯化MSCs,并从形态、表型、肝细胞样细胞分化潜能三方面进行鉴定;随后将UC-MSCs通过外周静脉回输给肝硬化腹水患者,对照组给予生理盐水回输,观察UC-MSCs回输对患者生化指标以及凝血机制、甲胎蛋白、血常规等的影响,测定并比较回输后两组患者的肝功、下腹腹水及终末期肝病评分模型(the model ofend-stage liver disease, MELD),评价UC-MSCs回输治疗失代偿期肝硬化患者的安全性及有效性;最后,通过体外实验,研究UC-MSCs是否影响肝星状细胞(hepaticstallete cells, HSCs)的活化及凋亡过程,探讨UC-MSCs治疗肝硬化的机制。 研究目的 通过对人UC-MSCs生物学特性的研究,建立一种分离、培养、扩增和鉴定UC-MSCs的实验方法;通过UC-MSCs外周静脉回输给肝硬化腹水患者,评价UC-MSCs回输治疗失代偿期肝硬化患者随访1年的安全性及有效性,明确UC-MSCs回输治疗适应症,为进一步制定合理的临床治疗方案奠定基础;通过体外实验,检测UC-MSCs对星状细胞(LX-2)活化、凋亡效应的影响,进一步探讨UC-MSC治疗肝硬化患者腹水减少的可能机制。 研究内容和方法 一、分离、培养及鉴定UC-MSCs 1、采用胰酶、胶原酶顺序消化法,分离培养UC-MSCs; 2、倒置显微镜观察培养UC-MSC细胞的形态,应用流式细胞仪鉴定细胞表型; 3、采用OSM、HGF联合bFGF的方法诱导人UC-MSCs向肝细胞样细胞分化; 二、UC-MSCs回输治疗失代偿期肝硬化患者的临床实验 1、采用前瞻性、平行对照分组法,将本中心收治的54例肝硬化腹水患者分为治疗组(38例接受UC-MSCs外周静脉回输治疗)和对照组(16例给予生理盐水回输),两组均同时行综合内科治疗; 2、观察两组患者回输术后临床症状、不良反应及并发症情况; 3、测定并比较不同时间点两组的生化指标以及AFP、WBC、PA;腹部B超检测并比较两组患者下腹腹水变化情况以及MELD评分。 三、UC-MSCs影响星状细胞(LX-2)活化及凋亡水平的体外检测 1、星状细胞的CFSE掺入; 2、星状细胞与不同浓度UC-MSCs的混合培养; 3、流式细胞仪检测星状细胞表达的α-SMA平均荧光密度值,及表达凋亡标记分子annexin V和7-AAD的LX-2的细胞比例。 研究结果 一、分离、培养及鉴定UC-MSCs 1、从人脐带中成功分离纯化得到MSCs; 2、细胞呈纤维状,表达CD44、CD105、CD73、CD90,不表达CD34、CD45、CD31以及HLA-DR等分子; 3、在细胞因子作用下,UC-MSC可被诱导分化为卵圆形肝细胞样细胞。 二、UC-MSCs回输治疗失代偿期肝硬化患者的临床实验 1、UC-MSCs回输治疗后,除个别患者体温有自限性升高外,无其它不良反应;治疗组与对照组的原发性肝癌发生率无明显统计学差异(P0.05);UC-MSCs回输对患者的相关生化指标等均无明显影响; 2、在回输后,大多数患者的乏力、纳差、腹胀、失眠等症状均不同程度改善; 3、治疗组与对照组的ALT、TBIL、CHE以及MELD评分均无明显统计学差异(P0.05),但UC-MSCs治疗患者在治疗36周后血浆ALB显著升高、下腹腹水量显著减少(P 0.05)。 三、UC-MSCs影响星状细胞活化及凋亡水平的体外检测 1、UC-MSCs以剂量依赖的方式抑制星状细胞的活化,并且抑制效应的产生不直接依赖于细胞之间的相互接触,而依赖于细胞因子的分泌; 2、UC-MSCs以剂量依赖的方式促进星状细胞的凋亡,最大可促进LX2凋亡达2倍以上,并且其促进凋亡同样不依赖于细胞之间的相互接触,而依赖于细胞因子的分泌。 结论 1、采用胰酶、胶原酶顺序消化法从人脐带中成功分离纯化得到MSCs,且分离细胞在体外可诱导为肝细胞样细胞,从而建立一种分离、培养、扩增和鉴定UC-MSCs的实验方法; 2、人UC-MSCs治疗失代偿期肝硬化患者安全性好,能改善患者的临床症状和肝功能,升高白蛋白水平,减少腹水生成,对临床上顽固性腹水及低蛋白状态患者具有良好的应用前景; 3、UC-MSCs回输不仅可改善低蛋白血症,而且因旁分泌机制为主的多种治疗作用,提高了肝细胞合成、代谢、灭活功能,并且通过调节星状细胞的活性及凋亡,可潜在降低肝窦门脉压力,从而减少腹水形成及预防食管胃底静脉曲张出血; 4、UC-MSCs治疗失代偿肝硬化安全性好、可显著升高血浆白蛋白、减少腹水,可成为一种新的治疗失代偿性肝硬化的临床选择;大样本、多中心、随机、双盲、对照研究将进一步明确uc-msc的长期疗效。
【学位授予单位】:中国人民解放军军医进修学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R575.2

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【参考文献】
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