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《第二军医大学》 2015年
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长链非编码RNA BACE1-AS促进Aβ聚集及其调节BACE1和SERF1a的ceRNA机制研究

蒋俊锋  
【摘要】:据估计在全球有2400万人患有痴呆症,其中,大部分都被认为患有阿尔茨海默氏症疾病。因此,阿尔茨海默氏症是一个重大的公共卫生问题,是重点研究的领域。尽管存在可以减轻阿尔茨海默氏病的症状的对症治疗,但其发病机制亟待更深入的研究。阿尔茨海默氏病(AD)的主要病理标志之一是脑组织中淀粉样斑块的。其主要组成部分为淀粉样蛋白β(Aβ),Aβ的过度生成并聚集对记忆力有明显负面影响,是AD发病的关键环节。Aβ的产生过程依赖于其前体,淀粉样前体蛋白(APP),被beta-分泌酶(BACE1)和gama-分泌酶在其内部切割。而且目前已知beta-分泌酶(BACE1)在患有阿尔茨海默氏病患者脑组织中表达水平以及其切割酶活性是明显提高的,因此,BACE1被认为在AD的发病机制中起关键调节作用。然而,BACE1的调控因子以及在AD患者脑组织中表达上调的机制还并不完全清楚。关于Aβ聚集同样在AD的发病过程中起重要作用,淀粉样斑块作为AD的病理标志,其结构基础就是Aβ的聚集,最近有文献报道Aβ在不同临床表现的AD患者脑组织中淀粉样蛋白β(Aβ)的聚集后的分子结果构象不同,Aβ原纤维结构不同,因此,除了Aβ的产生过程中的调控因子,淀粉样蛋白β的聚集及参与淀粉样蛋白β聚集过程的调控因子及其调控机制对于理解AD的产生与发展也至关重要。目前对于Aβ聚集的研究还比较有限,虽然目前发现了一个极为重要的促进Aβ聚集的因子----SERF1a,然而,SERF1a的调控因子还不清楚,其调控因子在AD患者脑组织中表达是否有改变,这种改变又是通过何种机制发生的目前也不清楚,因此,找到调节SERF1a的关键因子,对于理解AD的发病机制以及为将来AD临床诊断和治疗都非常重要。长链非编码RNA(lnc RNA),也可能在AD的发病过程中起着重要的作用。长链非编码RNA也是一类非编码RNA,其特点是长度超过200个核苷酸,但并不能翻译为蛋白质。在以前的报告中,Faghihi和他的同事报道了一条lnc RNA,BACE1-AS,在AD患者脑组织中表达增加。BACE1-AS还被发现可以增加BACE1的m RNA的水平,而这种对BACE1的m RNA的表达水平增加的作用机制,被认为是通过BACE1-AS通过其与BACE1的m RNA互补的区段与BACE1的m RNA相结合后,使得BACE1的m RNA的稳定性增加,从而降解减少使得BACE1的m RNA的表达水平增加。然而,作为新发现的长链非编码RNA,目前还不清楚何种因子在调节BACE1-AS,而且BACE1-AS是否有其他的生物学功能和调节的目标更不清楚。最近有几个报告已经提供了一个lnc RNA通过与micro RNA(mi RNA)相互作用而发挥功能的作用机制模型,那就是lnc RNA可充当竞争性内源RNA(ce RNA)而发挥作用。该机制模型的基本含义是,内源性的RNA可以互相竞争性的结合mi RNA,从而保护同样被这些mi RNA抑制的其他内源性RNA。这种ce RNA机制是一种广泛存在的RNA相互作用并调节的机制,然而该机制是否在神经系统中起作用,尤其是否参与AD的发病机制还不清楚。因此,本博士研究课题主要围绕BACE1-AS这条长链非编码RNA展开,旨在寻求以上问题的答案。其主要的研究方案是通过过表达以及干扰BACE1-AS,研究AD相关因子以及病理过程的改变。我们通过系统的实验发现,BACE1-AS可以通过发挥竞争性内源RNA的作用,与BACE1竞争性的结合靶向BACE1的mir-29b,mir-107,mir-124,mir-485和mir-761,从而保护BACE1不被这些mi RNA抑制,从而上调BACE1,促进Aβ生成。BACE1-AS还可以与SERF1a BACE1竞争性的结合靶向SERF1a的mir-1273,mir-1285和mir-3064,从而保护SERF1a,使SERF1a表达上调,进而促进Aβ聚集。由于Aβ的生成和聚集是AD发病的关键环节,因此我们的发现表明BACE1-AS在AD的发病过程中起着重要的作用,并提出AD发病的新的机制。第一部分:长链非编码RNA BACE1-AS促进Aβ的聚集方法:(1)在构建Aβ过量生成的细胞模型,并在该模型中,过表达以及干扰BACE1-AS后,通过Western-blot检测Aβ的量以及聚集情况。(2)排除BACE1-AS对BACE1的影响后,用Western-blot检测BACE1-AS对Aβ聚集的影响。(3)利用免疫荧光检测过表达以及干扰BACE1-AS后,Aβ聚集情况。(4)体外Aβ聚集动态检测实验实时检测过表达及干扰BACE1-AS后的细胞裂解产物对Aβ体外聚集动力学影响。(5)cck8CCK-8细胞活性检测试剂盒以及Tunel TUNEL检测试剂盒检测BACE1-AS影响Aβ后的细胞毒作用。(6)Western-blot检测BACE1-AS影响Aβ后的Tau蛋白磷酸化水平的变化。(7)通过直接添加BACE1-AS的RNA于体外聚集实验中,明确BACE1-AS对Aβ的聚集的影响是直接效应还是间接效应。(8)筛选BACE1-AS对Aβ聚集影响的调节因子。(9)证实选出调控因子的作用。(10)在不同细胞中验证BACE1-AS对SERF1a影响的普遍性。(11)敲除Dicer后研究BACE1-AS对SERF1a的影响,明确mi RNA是否参与调控。结果:(1)成功构建Aβ过量生成的细胞模型,并通过Western-blot检测发现,相对于对照,过表达BACE1-AS后,Aβ生成增加,并且有更多更高分子量的Aβ聚集物出现,干扰BACE1-AS后,Aβ生成减少,并且有高分子量的Aβ聚集物减少,最高分子量大小低于对照的最高聚集物分子量大小。(2)直接过量表达Aβ,使得BACE1-AS对AS的含量影响不大的情况下,Western-blot检测发现,相对于对照,过表达BACE1-AS后,依然有更高分子量的Aβ聚集物出现,干扰BACE1-AS后,最高分子量大小低于对照的最高聚集物分子量大小。(3)利用免疫荧光检测证明BACE1-AS促进Aβ聚集。(4)体外Aβ聚集动态检测实验证实过表达BACE1-AS的细胞裂解物使Aβ聚集加快。(5)CCK-8细胞活性检测试剂盒以及TUNEL检测试剂盒检测发现BACE1-AS影响Aβ后细胞毒作用增加。(6)Western-blot证明BACE1-AS影响Aβ后的Tau蛋白磷酸化水平升高。(7)直接添加BACE1-AS的RNA于体外聚集实验中,发现BACE1-AS本身不能直接促进Aβ的聚集。(8)通过过表达BACE1-AS,筛选AD相关基因的变化水平,明确SERF1a受BACE1-AS的调控。(9)实验证实BACE1-AS确实调控SERF1a的表水平。(10)BACE1-AS对SERF1a的影响具有神经组织特异性。(11)敲除Dicer后,BACE1-AS对SERF1a的上调减弱,说明mi RNA参与BACE1-AS对SERF1a的调控。结论:体外实验证实长链非编码RNA BACE1-AS促进Aβ的聚集,且Aβ的生成增加不是该过程的必要条件。BACE1-AS本身不直接影响Aβ的聚集,而是通过上调SERF1a促进Aβ的聚集。BACE1-AS对SERF1a的影响具有神经组织特异性,mi RNA参与BACE1-AS对SERF1a的调控过程。第二部分:BACE1-AS通过竞争内源RNA机制上调SERF1a方法:(1)生物信息学分析筛选BACE1-AS与SERF1a分享的mi RNA。(2)荧光素报告基因实验,,qrt-PCR,Western-blot等实验筛选确认BACE1-AS与SERF1a分享的mi RNA。(3)mi RNA结合位点突变体实验研究BACE1-AS对SERF1a的影响是否依赖于与mi RNA的结合。(4)精确定量测定SH-SY5Y细胞中相关因子表达拷贝数。(5)CCK-8,qrt-PCR,Western-blot等实验探索这些mi RNA对AD相关表型是否有影响。(6)qrt-PCR检测BACE1-AS对这些mi RNA是否有影响。(7)Northern-blot以及mi RNA半衰期检测BACE1-AS对mi RNA降解的影响。(8)RNA免疫共沉淀研究BACE1-AS与mi RNA是否有直接结合。(9)竞争实验证探索BACE1-AS是否通过竞争性结合mi RNA机制保护SERF1a。结果:(1)生物信息学分析筛选出9条BACE1-AS与SERF1a分享的mi RNA。(2)荧光素报告基因实验,qrt-PCR,Western-blot等实验筛选确认mir3064,mir1285,mir1273为BACE1-AS与SERF1a分享的mi RNA。(3)突变mi RNA结合位点的BACE1-AS不能上调SERF1a。(4)精确定量测定SH-SY5Y细胞中BACE1-AS,SERF1a以及三条mi RNA有互相形成ce RNA机制的拷贝数基础。(5)CCK-8,qrt-PCR,Western-blot等实验发现三条mi RNA抑制AD相关表型,是AD的保护因子。(6)qrt-PCR发现BACE1-AS下调这些mi RNA的成熟体而不影响其前体。(7)Northern-blot以及mi RNA半衰期检测证实BACE1-AS促进三条mi RNA的降解。(8)RNA免疫共沉淀证实BACE1-AS与mi RNA直接结合。(9)竞争实验证实BACE1-AS通过竞争性结合mi RNA机制保护SERF1a。结论:mir3064,mir1285,mir1273既可以下调BACE1-AS又可以下调SERF1a,BACE1-AS通过竞争内源性RNA机制,与SERF1a竞争性的结合mir3064,mir1285,mir1273,保护SERF1a不被这些mi RNA降解,从而上调SERF1a。第三部分:BACE1-AS通过竞争内源RNA机制上调BACE1方法:(1)构建缺失了与BACE1形成双链区段的突变型BACE1-AS-Δ,研究BACE1-AS其他区段对BACE1是否有影响。(2)构建BACE1-AS中仅含与BACE1形成双链的互补区段的突变型BACE1-AS-complementary,研究BACE1-AS对BACE1的影响是否依赖形成双链RNA。(3)生物信息学方法筛选,荧光素报告基因实验,qrt-PCR,Western-blot等实验证实是否存在BACE1-AS与BACE1分享的mi RNA。(4)用第二部分方法证实BACE1-AS通过竞争内源RNA机制上调BACE1。结果:(1)缺失了与BACE1形成双链区段后,BACE1-AS-Δ依然可以上调BACE1。(2)过表达仅含与BACE1形成双链的互补区段的突变型BACE1-AS-complementary表达载体,BACE1不能被上调。(3)找到并证实BACE1-AS与BACE1分享mir-29b,mir-107,mir-124,mir-485,mir-761。(4)qrt-PCR发现BACE1-AS下调这些mi RNA的成熟体而不影响其体,Northern-blot以及mi RNA半衰期检测证实BACE1-AS促进这些mi RNA的降解,RNA免疫共沉淀证实BACE1-AS与mi RNA直接结合,竞争实验证实BACE1-AS通过竞争性结合mi RNA机制保护SERF1a。结论:BACE1-AS对于BACE1的影响机制不限于互相形成双链RNA,BACE1-AS对BACE1的上调依赖于与mir-29b,mir-107,mir-124,mir-485和mir-761的结合。BACE1-AS通过竞争内源性RNA机制,与BACE1竞争性的结合mir-29b,mir-107,mir-124,mir-485和mir-761,保护BACE1不被这些mi RNA降解,从而上调BACE1。第四部分:动物实验及AD病人中研究相关基因表达情况方法:(1)在APP/PS1转基因AD小鼠脑组织通过注射BACE1-AS过表达慢病毒颗粒(LV-BACE1-AS)过表达BACE1-AS,体内实验研究BACE1-AS对Aβ的影响。(2)检测BACE1-AS在体内对BACE1和SERF1a以及相应mi RNA的影响。(3)分析已有GEO数据库中AD病人脑组织中基因表达情况,分析本文相关基因表达情况。结果:APP/PS1转基因小鼠中过表达BACE1-AS后发现:(1)Aβ生成和聚集增加;(2)脑组织中SERF和BACE1表达上调,靶向BACE1的mir-29b,mir-107,mir-124,mir-485,和靶向SERF1a的mir3064,mir1285和mir1273表达下调。分析已有GEO数据库中AD病人脑组织中基因表达情况后发现。(3)共同靶向BACE1-AS和BACE1的mi R-485,mi R-107以及共同靶向BACE1-AS和SERF1a的mi R-1273d,mi R-3064在AD患者脑组织中明显下调;(4)首次证实SERF1a在AD病人脑组织中表达上调,且其表达量与BACE1,TAU,PSEN1以及PSEN2正相关。结论:体内实验证实BACE1-AS促进Aβ生成和聚集,并佐证体外实验证实的BACE1-AS通过ce RNA机制实现对BACE1和SERF1a的上调作用。AD患者脑组织中确实有SERF1a表达的上调,并有本文提出的ce RNA机制相关因子,如mi R-485,mi R-107,mi R-1273d,和mi R-3064的相应变化。小结聚集的淀粉样蛋白-β(Aβ)是阿尔茨海默病(AD)的主要病理特征之一,Aβ以及其生成和聚集的调节因子受到广泛关注,然而,这些因子在AD的发病过程中的转录后调控机制却所知甚少。我们通过系统的实验报道了一些证据说明一条被称作BACE1-AS的已知长链非编码RNA可以通过上调SERF1a来促进Aβ的聚集,而SERF1a被证实是淀粉样蛋白质聚集的直接调节因子,并可以增加Aβ的细胞毒性。我们还发现BACE1-AS在转录后水平上调BACE1和SERF1a,其机制是通过发挥竞争性内源RNA的作用,分别与BACE1以及SERF1a竞争性的结合靶向BACE1和SERF1a的mi RNA,从而保护BACE1和SERF1a。我们还通过体内实验在APP/PS1转基因小鼠中发现过表达BACE1-AS后,SERF1a和BACE1表达上升,相应mi RNA表达下降,Aβ的聚集增加。最后通过分析AD患者脑组织中相关基因的表达水平进一步证实BACE1-AS在AD中的作用。我们的结果提出BACE1-AS可以作为内源性竞争RNA吸附mi RNA,调控BACE1和SERF1a,使三者到达稳定的动态平衡,该调控过程的紊乱会造成Aβ的聚集增多,促进AD相关的病理过程的发生发展。
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R749.16

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