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《第二军医大学》 2014年
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Gankyrin调控自噬及其在肝癌进展中的作用及机制研究

罗韬  
【摘要】:研究背景和目的 自噬是一种极其保守的,将胞浆内的物质转移到溶酶体进行降解的过程。一般可以分为大分子自噬,小分子自噬,伴侣分子介导的自噬三种类型,分别介导不同的底物降解,其中以大分子自噬为主要类型,因而也将其简称为自噬(autophagy)。自噬的主要功能在于在各种应激条件下(营养缺乏等),将胞内的细胞器以及蛋白聚合物包裹起来形成双层膜结构的小泡,进而与溶酶体结合,将其内包裹的物质降解以供给细胞,保护细胞免于死亡。自噬功能的正常运作对生物体及其重要,自噬功能异常会引起多种疾病,如神经退行性变性,病毒感染,炎性肠病,肿瘤等。自噬在肿瘤的发生发展过程中起着双刃剑的作用:在肿瘤形成早期,自噬可以通过降解细胞内异常的蛋白聚合物以及细胞器,达到清除细胞内异常蛋白,维持细胞稳态,从而抑制肿瘤的发生;当肿瘤形成以后,肿瘤细胞通过自噬降解多余的细胞器以及蛋白聚合物以满足肿瘤生长的需要,抵御化疗药物对肿瘤细胞的杀伤,从而促进肿瘤的进展。因而,化疗药物联用自噬抑制剂治疗肿瘤越来越受到人们的关注。 Gankyrin是人26S蛋白酶体的一个非ATP酶调节亚基,包含七个ankyrin序列。2000年发现其在人肝癌组织中的高表达。Gankyrin可以与泛素蛋白连接酶MDM2相互结合,通过影响P53的泛素化,从而调节p53的降解;可以与CDK4结合,从而影响肿瘤抑制蛋白Rb的磷酸化情况,加快细胞周期进程;可以和NF-kb/RelA结合,促进RelA的出核,从而抑制其转录活性;可以通过RhoA/ROCK信号通路参与Ras诱发的肺癌进程;可以通过上调PI3K/AKT/HIF-1alpha途径影响肝癌的侵袭和转移;可以通过抑制Wwp2对Oct4的降解激活并维持肝癌起始细胞的功能;通过上调HNF-4alpha影响肝癌的去分化。这些研究结果都提示我们Gankyrin在肿瘤的发生发展过程中起着无可替代的重要作用。 自噬在肿瘤的形成不可或缺,已有研究报道一些癌基因(如HBX,H-Ras)可以通过影响自噬从而促进肿瘤的进展。并且近年来自噬作为治疗肿瘤的一种重要手段已经进入临床试验。Gankyrin是影响肝癌发生发展的重要癌基因,可以通过蛋白与蛋白相互作用影响多种信号通路,从而促进肝癌及其他肿瘤的进展。但是Gankyrin是否影响自噬的功能,特别是在营养缺乏以及肿瘤药物作用情况下还未见报道。本研究旨在探讨Gankyrin在肝癌细胞自噬进展过程中的作用及机制,加深我们对Gankyrin作为肝癌重要节点分子的信号调控网络的了解,为Gankyrin研究成果向临床应用转化提供重要的科学依据。 研究方法: 1.通过Gankyrin过表达稳定细胞系以及干扰病毒,实现在细胞中对Gankyrin表达水平的影响。检测Gankyrin过表达稳定细胞系以及在肝癌细胞中瞬时干扰Gankyrin,在EBSS,sorafenib等刺激条件下,Gankyrin对自噬marker分子LC3-Ⅱ的表达,GFP-LC3的形成以及细胞内自噬泡的多少的影响。 2.构建Gankyrin转基因小鼠,通过饥饿处理研究Gankyrin在自噬发生中的作用,通过诱导肝癌模型研究Gankyrin在肝癌进展中的功能。 3.通过免疫印迹实验研究Gankyrin是否通过p53影响自噬的发生。 4.通过免疫共沉淀实验研究在EBSS处理条件下,与Gankyrin结合的自噬相关分子,通过激光共聚焦实验验证Gankyrin与自噬相关分子Atg7的结合。通过Gankyrin截断体以及Atg7截断体分别研究两者相互作用的具体位点。 5.通过western blot实验方法检测Gankyrin在蛋白水平对Atg7的影响。通过转录,翻译以及降解抑制剂研究Gankyrin调控Atg7的具体方式。通过RT-PCR的方式验证Gankyrin是否通过影响转录上调Atg7的表达。 6.通过si-RNA的方法,在过表达Gankyrin的情况下干扰Atg7的表达,验证Gankyrin是否通过Atg7影响LC3-Ⅱ的表达以及自噬泡的形成。 7.通过核浆分离实验以及激光共聚焦实验研究Gankyrin在营养缺乏条件下的细胞定位情况。 8.通过染色质免疫共沉淀研究Gankyrin在饥饿条件下在细胞核中的功能。 9.通过Luciferase报告基因实验Gankyrin在细胞核中调控Atg7转录的具体机制。 10.通过核浆分离联合免疫共沉淀实验研究Gankyrin在细胞核中发挥功能的具体方式,通过激光共聚焦实验验证Gankyrin在细胞核中是否与HSF1相互结合。通过si-RNA的方法,研究Gankyrin对Atg7表达的调控是否依赖于HSF1。 11.通过免疫组化以及免疫印迹实验研究Gankyrin与Atg7在临床肝癌样本中的表达情况以及相关性,通过统计分析研究两者联用对临床预后的意义。 12.通过细胞存活实验研究在sorafenib刺激条件下Gankyrin对肝癌细胞的保护作用,通过凋亡实验以及免疫印迹实验研究Gankyrin的抗凋亡功能。 13.通过自噬抑制剂研究Gankyrin对sorafenib刺激条件下的抗凋亡功能是否依赖于其对自噬功能的调控。通过si-RNA的方法研究Gankyrin对sorafenib的抗凋亡功能是否依赖于Atg7. 14.通过皮下荷瘤实验在体内条件验证Gankyrin对sorafenib的耐药性是否依赖于其对自噬的影响。 结果: 1. Gankyrin在饥饿条件以及sorafenib等肿瘤药物刺激下可以促进自噬marker分子LC3-Ⅱ的表达,p62的降解,GFP-LC3以及细胞内自噬泡的形成。 2.在动物体内条件下,Gankyrin可以促进饥饿小鼠肝脏以及诱导肝癌模型中的自噬形成。 3. Gankyrin对自噬的调控并不依赖于p53。 4. Gankyrin在营养缺乏条件下并不能与Beclin1,Atg5,Atg12相互结合,可以与Atg7结合,并且这种结合随着刺激时间逐渐增强。 5. Gankyrin主要通过后三个Ankyrin以及N端序列与Atg7结合,Atg7并不通过酶活性区域与Gankyrin结合。 6. Gankyrin可以上调Atg7的蛋白表达水平以及mRNA水平。 7. Gankyrin对自噬的调控依赖于Atg7的功能。 8. Gankyrin在营养缺乏条件下可以进入到细胞核中。 9. Gankyrin可以结合到Atg7的启动子区。 10. Gankyrin对Atg7的调控依赖于HSF1。 11. Gankyrin主要通过在细胞核中与HSF1相互结合影响其对Atg7的转录调控。 12.在临床肝癌样本中,Gankyrin与Atg7的表达量相关,两者联合可以作为肝癌病人预后的预测指标。 13. Gankyrin可以抑制sorafenib以及化疗药物对肝癌细胞的杀伤作用,而这种抗药作用依赖Gankyrin对自噬功能的调控。 结论: 本研究首次发现Gankyrin对自噬功能的调控,并发现其可以通过在胞浆中与Atg7结合以及进入到细胞核中与HSF1作用上调Atg7表达这样两种一快一慢,相互补充的机制调控自噬的进展。Gankyrin与Atg7可以作为预测肝癌预后的指标。Gankyrin可以作为临床上化疗药物联用自噬抑制剂是否适用的重要的分型标志物。
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:R735.7

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【共引文献】
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