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《第二军医大学》 2017年
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Dpr1通过Akt/mTOR通路调控肝再生过程中自噬介导的脂代谢

董子慧  
【摘要】:肝再生是一个涉及多细胞、多因素、多信号通路参与的极其复杂的生物学过程,早在19世纪就开始对肝再生的过程进行相关研究,迄今为止,虽然对肝再生的主要影响因素、参与的信号通路以及启动终止的过程都有了较为深入的认识,但是依然存在许多尚未解开的谜团。再生早期,肝脏会出现暂时性的脂肪样改变,研究多认为脂肪变性的目的是为肝再生提供充足的能量,促使肝再生顺利进行,但其具体机制尚不明了。肝脏摄取的FFA(游离脂肪酸)可以在肝细胞浆内以脂滴的形式存在,当机体能量供给不足时,脂滴可被自噬小体吞噬后转运至溶酶体,在溶酶体内降解成FFA,FFA进入线粒体后,完成β-氧化,产生大量的ATP(腺苷三磷酸),为机体供能,自噬通过上述过程参与正常肝脏细胞脂肪代谢过程中脂滴的降解。同时,有研究证明:在神经系统中,DPR1分子可以通过稳定自噬形成过程中的Vps34-Beclin1-Atg14L复合物从而正向调控细胞自噬。在本研究中我们发现:肝实质细胞特异性敲除Dpr1基因导致小鼠在肝切除术后早期肝脏出现明显的脂肪变性,且持续时间明显延长。表明在肝实质细胞中缺失Dpr1会影响肝脏的脂质代谢。肝实质细胞特异性敲除Dpr1基因的小鼠出现自噬相关分子——LC3-II表达的下调,P62的上调,表明Dpr1在细胞自噬过程中起促进作用,而自噬又参与脂质降解过程,我们分离并获取小鼠原代肝细胞,体外给予油酸处理,发现敲除组细胞自噬水平低下,且细胞内出现明显脂滴聚集。表明Dpr1参与了自噬介导的脂滴降解过程。最后,我们在小鼠体内以及原代肝细胞水平分别给予自噬诱导剂处理后,发现敲除组的自噬能力可明显提升,提示Dpr1作用于自噬发生的上游相关环节,接着我们检测发现Akt-mTOR通路明显活化。表明Dpr1可通过抑制Akt的磷酸化激活,阻断该通路活化,进而促进自噬的发生。综上所述,本研究旨在揭示DPR1分子可以通过抑制Akt的磷酸化,诱导增强肝细胞的自噬水平,从而加快肝细胞内脂滴降解速率,为肝再生提供充足的能量,推动肝再生的进程。【实验方法】1、乙醚吸入性麻醉状态下,结扎、切除小鼠肝脏左外叶及中叶,构建2/3肝切除术的动物模型,分别于术后0、6、12、24、48、72、120、168h这8个时间点处死小鼠,对小鼠体重及肝重进行称量,并收集肝脏的新鲜组织、冰冻组织、石蜡组织、以及血液标本。2、采用两步灌注法和密度梯度离心法,分离并获取小鼠原代肝实质细胞,培养并给予相关刺激,完成体外细胞实验。3、通过蛋白免疫印迹法、免疫组织化学法检测两组小鼠增殖相关分子的表达情况。4、通过HE染色观察两组小鼠肝脏组织形态学差异。5、通过冰冻组织免疫荧光染色法观察两组小鼠肝脏的细胞大小。6、通过油红和尼罗红染色法分别在体内、原代细胞水平检测两组小鼠肝脏脂质含量。7、通过蛋白免疫印迹法、电镜以及RFP-GFP-LC3双标腺病毒法检测两组小鼠肝脏自噬水平、脂质含量。【实验结果】1、再生早期,Dpr1敲除组小鼠死亡率明显高于对照组,肝损伤重于对照组,而肝体比恢复速率快于对照组,但两组增殖能力没有明显差异。2、再生早期,Dpr1敲除组小鼠肝细胞体积明显大于对照组。3、Dpr1敲除组小鼠再生早期,肝脏脂质含量明显高于对照组。4、Dpr1敲除组小鼠自噬相关蛋白表达水平明显低于对照组。5、原代肝实质细胞培养发现:未给予任何处理时,敲除组细胞其自噬水平低于对照组,脂质含量高于对照组。6、检测自噬上游相关调控通路,发现敲除组PI3K-Akt-m TOR信号通路明显活化。7、体内、外分别给予mTOR抑制剂--Rapamycin、RAD001以及Akt抑制剂--MK2206,处理后,发现敲除组自噬水平明显提升,脂肪变性得以缓解。【实验结论】在正常的肝再生早期阶段,肝脏会出现短暂的脂肪变性,研究表明其与再生过程中能量供应有关,而正常情况下肝细胞内脂滴可通过自噬溶酶体途径降解,本课题研究认为在肝再生过程中自噬同样通过降解脂滴的形式参与了肝脏内脂质降解过程,而DPR1则通过抑制Akt-mTOR信号通路的活化促进自噬,从而加速脂滴的降解过程。
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R575

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【参考文献】
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