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《第二军医大学》 2017年
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4种植物药提取物及21种单体成分对羧酸酯酶2的抑制作用研究

李洁  
【摘要】:植物药在世界范围内使用日益广泛,尤其是在肿瘤、HIV、以及精神生理方面的辅助治疗中,植物药逐渐显露一些独特优势。由于植物药成分复杂,人们对许多植物药与药物代谢酶的影响缺乏认知,造成植物药-化药的药物代谢性相互作用难于预防和治疗。五味子、桑白皮、甘草、血竭是使用非常广泛的植物药,临床上许多制剂都含有与之相关的成分,与化药联合使用的可能性较大。羧酸酯酶(CES)是一类药物代谢I相酶,属丝氨酸水解酶家族,广泛分布于哺乳动物体内,它是大部分前药代谢活化过程中的一个关键性酶类。人类羧酸酯酶绝大部分属于羧酸酯酶1(CES1)或羧酸酯酶2(CES2)家族。CES2主要分布在小肠中,负责对口服药物分子的首过代谢以及肠道小分子游离脂肪酸酯代谢,主要水解较大乙醇基和较小乙酰基的底物,如阿司匹林、普鲁卡因和伊立替康等。其中CES2还是导致伊立替康在小肠蓄积发生致命的迟发性腹泻的关键因素,通过抑制肠道肿瘤细胞中高含量的羧酸酯酶2(CES2)可缓解伊立替康导致的严重腹泻症状。近年来还有研究发现肥胖、糖尿病患者CES2表达水平显著升高。从植物药发现特异性羧酸酯酶2抑制剂或先导化合物,可以为植物药-化药代谢性相互作用评价提供部分依据,亦可成为治疗羧酸酯酶2相关疾病(如SN-38蓄积导致的迟发性腹泻、肥胖、糖尿病等)提供备选方案。目的:本文采用荧光素乙二酸酯(FD)作为CES2的特异性荧光探针,在体外人肝微粒体(HLM)体系中检测五味子、桑白皮、甘草、血竭提取物及单体成分作用后CES2的残余活性,筛选CES2强抑制作用的单体成分,进一步探究抑制类型,从植物药发现特异性羧酸酯酶2抑制剂或先导化合物,可以为植物药-化药代谢性相互作用评价提供部分依据,亦可成为治疗羧酸酯酶2相关疾病提供备选方案。方法:1.制备五味子、桑白皮、甘草、血竭提取物,采用HPLC法进行样品鉴定。在人肝微粒体反应体系中,分别将上述植物药提取物与CES2的探针底物FD在37℃条件下共同孵育,不加抑制剂组作为对照组,采用荧光酶标仪测定孵育液中FD的代谢产物的生成量,通过分析CES2的残余活性,判断四种植物提取物对CES2的抑制程度。2.检测植物药单体成分及木犀草素对CES2抑制的量效关系,筛选出残余活性50%的单体,测定其对CES2抑制的IC_(50)值。3.对筛选出的CES2强抑制剂(IC_(50)5μM)进行酶抑制动力学研究,选择不同浓度的单体标准品溶液和不同浓度的探针底物浓度,计算单体对CES2抑制动力学参数,判断抑制类型。结果:1.四种植物药对CES2均有一定抑制作用,其中桑白皮提取物的抑制作用最强,CES2残余活性为1.3%,血竭提取物次之,CES2残余活性25.3%,五味子提取物最弱,残余活性33.6%。2.活性较强的单体成分包括:五味子甲素23.49%、戈米辛J 34.59%、戈米辛G 42.98%、五味子酯戊34.14%;桑根酮C(SC)3.88%、桑根酮D(SD)5.24%、桑黄酮G(KG)7.92%;甘草素5.62%、甘草查尔酮A1.68%、甘草次酸43.25%、木犀草素17.81%;龙血素A22.12%、龙血素B23.39%。植物药单体对CES2抑制IC_(50)值分别为:五味子甲素8.06μM、五味子酯戊38.6μM、戈米辛J 48.7μM、戈米辛G19.5μM、SD 1.09μM、KG 1.14μM、SC 1.02μM、甘草查尔酮A1.2μM、甘草素0.58μM、甘草次酸81.18μM、木犀草素3.02μM、龙血素A 46.61μM、龙血素B45.6μM。桑根酮C(SC)、桑根酮(SD)、桑黄酮(KG)、木犀草素、甘草查尔酮A、甘草素对CES2呈现浓度依赖性抑制,且Lineweaver-Burk作图,交点交于第二象限横坐标,表明六种单体成分成分对CES2的抑制类型为非竞争性抑制。6种单体Ki分别为甘草查尔酮A0.58μM,甘草素0.83μM,SC 0.76μM,SD 0.97μM,KG 1.09μM,木犀草素6.90μM。讨论:桑根酮C(SC)、桑根酮(SD)、桑黄酮(KG)、木犀草素、甘草查尔酮A和甘草素对CES2的体外抑制作用强(IC_(50)5μM),戈米辛J、戈米辛G、五味子酯戊、龙血素A和龙血素B对CES2有中等强度的抑制作用(5μMIC_(50)50μM),甘草次酸对CES2的抑制作用弱(50μMIC_(50)100μM)。本研究首次证实这六种天然产物单体成分具有CES2强效抑制活性,为此类植物药-化药代谢性相互作用评价提供部分依据,亦可为治疗CES2相关疾病(如SN-38蓄积导致的迟发性腹泻、肥胖、糖尿病等)提供备选方案。
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R285

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