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《第二军医大学》 2017年
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ATRA调控Klf5在预防移植静脉术后狭窄的作用及机制研究

余咏潮  
【摘要】:研究背景及目的:冠状动脉搭桥术(Coronary artery bypass graft,CABG)是治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病的主要手段之一,目前CABG主要血管桥材料仍为大隐静脉,尽管手术操作、器械及术后治疗均有了很大改进,但术后静脉移植物血管阻塞(vein graft failure,VGF)仍严重影响了手术效果与患者预后。有文献报道术后10年VGF发生率超过50%。研究显示,超过90%的近期VGF(术后1月内)由急性血栓引起,给予患者术后抗凝可有效改善近期VGF发生率。但是,超过60%的远期VGF(术后10年以内)主要与移植物血管平滑肌细胞(smooth muscle cell,SMC)增生以及由于SMC增生所导致的血小板粘附、粥样斑块形成相关。然而,目前对于VGF过程中SMC增生的机制尚未明了,也无有效性的治疗及预防手段。而这也正成为影响CABG术后远期手术效果的重要原因,是目前心脏外科的研究重点。全反式维甲酸(all—trans retinoic acid,ATRA)是人体内维生素A的代谢中间产物。ATRA作用广泛,在动物生长发育及细胞分化过程中有重要作用。随着对ATRA的研究不断拓展,大量基础研究显示ATRA与心血管疾病有密切的关系。如抑制血管内皮细胞的增殖、抑制血管平滑肌细胞的增殖等。而抑制血管平滑肌细胞增殖是预防VGF的有效方法。基于目前已有报道的大量基础研究,我们推测可以通过使用ATRA抑制CABG术后静脉桥血管平滑肌细胞增殖,从而有效预防VGF。KLF5(Krüppel-like Factor 5)是KLF家族中与胚胎发育、细胞增殖和肿瘤发生密切相关的转录调节因子。KLF5可以启动成肌分化抗原基因(Myogenic Differentiation Antigen,MyoD)的基因转录,从而使得损伤的肌细胞内肌原纤维、肌小管增生,加速肌肉组织的分化、增殖。国内外最新研究进展均证明,抑制KLF5的表达可以有效减轻血管平滑肌细胞的增生,而前文已述:ATRA可以抑制血管平滑肌细胞的增殖。因此我们大胆推测:ATRA是否可以通过调控Klf5的表达,抑制平滑细胞增生和分化,从而预防移植血管再狭窄?本课题拟研究ATRA调控Klf5在预防移植静脉术后狭窄的作用及机制研究。研究方法:一、动物实验部分。建立动物模型:选取42只新西兰大白兔,随机分为造模组(A组、B组、C组分别饲养2周、4周、8周)和ATRA组(D组、E组、F组分别饲养2周、4周、8周)、空白对照组(G组),各6只。ATRA组及造模组取右侧平行胸锁乳突肌切口,游离适当长度的颈静脉并与相应动脉进行替换移植,实验组术后予ATRA干预,造模组不予干预。空白对照组直接切除颈静脉获取血管标本;其余各组分别饲养2周、4周、8周后处死动物,获取移植静脉,切取标本。1、以A、B、C、G4组比较,观察静脉动脉化动物模型移植静脉管腔特点,免疫组化检验(KLF5、Ki67)明确Klf5在静脉移植术后血管中的表达及移植静脉血管平滑肌增殖情况;2、以A、B、C、D、E、F6组比较,分析ATRA预防静脉移植术后狭窄的效果及对Klf5表达的影响。二、体外实验部分。建立体外模型:分离培养大鼠主动脉平滑肌细胞(RATSMCs),-SMA染色行细胞鉴定,购买人脐静脉平滑肌细胞(Huvsmcs),然后分别使用人及大鼠KLF5腺病毒转染细胞,行western-blot明确其转染效果,建立KLF5过表达细胞模型。1、Klf5促进血管平滑肌细胞增生和迁移:行划痕实验、CCK-8实验明确血管平滑肌细胞增殖及迁移情况。2、ATRA通过阻断Klf5与RARa的相互作用抑制血管平滑肌细胞增生和迁移:行CCK-8实验证实ATRA抑制Klf5的促血管平滑肌细胞增殖作用;行划痕实验证实ATRA抑制Klf5的促血管平滑肌细胞迁移作用;行qPCR实验检测能被ATRA调控的Klf5的下游基因;行Western blot实验检测证实ATRA对Klf5下游基因的调控作用;行免疫共沉淀实验明确ATRA对Klf5-RARa结合的阻断作用。统计学方法:统计分析我们使用SPSS21.0软件,计量资料描述使用均数±标准差。两组间计量资料如服从正态分布及方差齐性采用两独立样本t检验;多组间计量资料如服从正态分布及方差齐性采用单因素方差分析,组间两两比较采用lsd-t检验方法。作图采用GraphPad软件。P0.05为差异有统计学意义。研究结果:1.静脉移植术后血管平滑肌细胞增殖能力显著升高,Klf5表达也明显升高。以“套管法”成功建立静脉动脉化动物模型,通过HE染色,光镜下测量发现静脉移植术后内膜及中膜增殖明显,通过免疫组化检测Klf5及Ki67发现,移植静脉Klf5比较空白对照静脉表达明显升高,反应平滑肌细胞增殖能力的Ki67表达也明显升高。2.ATRA可以预防静脉移植术后再狭窄,但对Klf5表达没有影响。通过HE染色,光镜下测量发现ATRA组静脉中膜及内膜增殖较对照组明显减轻,通过免疫组化检测Klf5及Ki67发现,反应细胞增殖能力的Ki67在ATRA组表达较对照组明显减轻,但Klf5表达未有明显区别。3.Klf5可以促进血管平滑肌细胞增生及迁移。建立体外细胞模型,行CCK8实验证实,使用Klf5转染后血管平滑肌细胞增殖能力明显增强,行划痕实验证实Klf5转染后血管平滑肌细胞迁移能力明显增强。4.ATRA影响Klf5的功能执行作用行Western-Blot检验证实ATRA对Klf5的表达水平无明显影响;行CCK8实验证实ATRA可以抑制Klf5促血管平滑肌细胞增生作用;行划痕实验证实ATRA可以抑制Klf5促血管平滑肌细胞迁移能力;行qPCR及Western-Blot检测证实ATRA可以抑制Klf5对下游基因的调控作用;行免疫共沉淀实验明确ATRA对Klf5-RARa结合的阻断作用。研究结论:ATRA可以通过对Klf5-RARa结合的阻断作用来抑制平滑肌细胞增生,进而预防静脉移植术后血管狭窄。
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R654.2

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