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《第二军医大学》 2017年
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DLC1通过促进MANF的分泌影响结肠癌细胞迁移的机制研究

彭海霞  
【摘要】:【研究背景及目的】随着生活水平和饮食结构的改变,自2000年至2011年间结直肠癌发病率和死亡率均持续上升,结直肠癌患者总的5年生存率约65%,与病理学分期密切相关,肿瘤细胞的侵袭转移是导致结肠癌高死亡率的原因之一。DLC1,也被称作p122Rho GAP、ARHGAP7以及STARD12是一类Rho家族蛋白的GAP,能够抑制肿瘤的发生及转移,在包括乳腺癌、结肠癌、肺癌等多种肿瘤中突变缺失,发生频率之高甚至能与明星分子p53相媲美。本文旨在探讨DLC1通过调控细胞因子MANF分泌从而抑制结肠癌细胞迁移作用机制。【实验方法】一、DLC1不同亚型对结肠癌细胞增殖及迁移的抑制作用。制备DLC1各亚型过表达慢病毒,通过CCK8和Transwell等实验方法,研究结肠癌细胞株中DLC1各亚型的表达及相关功能。二、DLC1 isoform 2的分泌蛋白对结肠癌细胞增殖及迁移的作用。收集过表达DLC1条件培养基培养野生型结肠癌细胞SW1116,通过CCK8和Transwell等实验方法,研究DLC1条件培养基对其功能的影响;并进一步通过蛋白银染查看DLC1条件培养基中的差异蛋白,并利用蛋白质谱检测。三、分泌蛋白MANF对结肠癌细胞增殖及迁移的作用。分别建立MANF过表达及敲低稳转细胞株,并浓缩收集上清,从细胞内及细胞外两方面,通过CCK8、transwell以及划痕实验等研究MANF在细胞内和细胞外分别对结肠癌细胞系增殖及迁移的影响。四、DLC1通过促进MANF的分泌影响结肠癌细胞迁移的发生。通过q RT-PCR检测DLC1对影响MANF分泌的基因的作用,并在敲低MANF的细胞系基础上过表达DLC1,利用transwell实验研究迁移功能的变化。五、统计学方法采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。组间两两比较采用配对样本test检验或秩和检验,多组样本均数的比较釆用两因素方差分析。P0.05表明差异有统计学意义。【实验结果】一、DLC1不同亚型在结直肠癌组织中均表达下调。isoform 1在19例结肠癌组织中表达下调(P=0.0091);isoform 2在19例结肠癌中表达下调(P=0.0094);而isoform 3表达在18例患者中下调(P=0.002)。二、DLC1 isoform 2及isoform 4过表达稳转细胞株SW1116相较vector细胞对增殖有明显抑制作用。DLC1 isoform 2及isoform 4过表达稳转细胞株SW1116相较vector细胞对增殖有明显抑制作用(P=0.002,P=0.008),而isoform 3的作用则不明显(P=0.150)。三、DLC1 isoform 2过表达稳转细胞株SW1116相较对照vector细胞对迁移有明显抑制作用。DLC1 isoform 2过表达稳转细胞株SW1116相较对照vector细胞对迁移有明显抑制作用(P=0.011),而isoform 3及isoform 4的作用则不明显(P=0.956,P=0.234)。过表达DLC1 isoform 2和isoform 4的稳转细胞株中,Snail及Vimentin均表达下调,而isoform 3的稳转细胞株中这两个蛋白表达变化不明显;而N-cadherin的表达变化均不明显。四、DLC1的条件培养基对野生型结肠癌细胞迁移的抑制作用。SW1116-DLC1的CM能够明显抑制野生型结肠癌细胞株HCT116和SW1116的迁移(相较对照组,P=0.0017及P=0.0002);但对野生型细胞的增殖无明显作用。五、SW1116-DLC1条件培养液浓缩后送检质谱,发现分泌蛋白MANF。通过分析LC-MS/MS质谱结果发现,过表达DLC1后能明显上调MANF蛋白在上清中的表达,但进一步q RT-PCR验证发现DLC1并未在细胞内调控其转录。六、细胞内过表达MANF后能够明显抑制结肠癌细胞的增殖作用。细胞内过表达MANF后能够明显抑制结肠癌细胞SW1116的增殖作用(P=0.0053),敲低MANF能促进结肠癌细胞的增殖(P0.05);细胞外过表达MANF对结肠癌细胞SW1116及HCT116的增殖无作用。七、细胞内及细胞外过表达MANF均能明显抑制结肠癌细胞的迁移作用。细胞内过表达MANF,能明显抑制SW1116的迁移作用(P0.01);细胞外过表达MANF(过表达MANF的CM以及重组蛋白MANF)能抑制野生型结肠癌细胞SW1116及HCT116的迁移作用(P0.01);细胞内或细胞外敲低MANF能促进结肠癌细胞的迁移(P0.01及P0.05)。八、DLC1下调GRP78及SERCA1的表达影响MANF蛋白分泌。结肠癌细胞SW1116中过表达DLC1,GRP78相对表达量下调为0.612±0.015(P0.01),SERCA1下调为0.543±0.079(P=0.015);进一步敲低DLC1(sh DLC-1以及sh DLC-4)后,GRP78表达上调为2.587±0.268(P0.01)以及1.423±0.0705(P=0.0267),而SERCA1表达上调为1.656±0.184(P=0.0371)以及1.888±0.1482(P=0.0267)。九、DLC1抑制结肠癌细胞SW1116的迁移需要MANF介导。在敲低MANF的基础上再次过表达DLC1后发现,结肠癌细胞SW1116迁移的细胞数仅稍低于对照组vector,却无明显统计学差异(P=0.0535以及P=0.0111)。【结论】DLC1的不同亚型在结肠癌组织中的表达均低于癌旁组织,且DLC1的isoform2对抑制结肠癌细胞的增殖及迁移作用最强。DLC1 isoform 2通过调节GRP78及SERCA1的表达以促进MANF的分泌达到影响结肠癌细胞迁移的发生。
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R735.35

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