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《第二军医大学》 2017年
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Linc00152在舌鳞癌恶性生物学行为中的作用与机制研究

李洪娇  
【摘要】:舌鳞状细胞癌(tounge squamous cell carcinoma TSCC)是头颈部最为常见的恶性肿瘤,起源于舌复层鳞状上皮。舌鳞癌的恶性程度高,易发生远处转移且预后较差;同时手术损伤大,严重影响患者的生活质量。目前舌鳞癌的研究主要集中以下几点:1、舌鳞癌中失调表达基因作为肿瘤标志物与预后判断指标的研究;2、舌鳞癌中基因失调表达的遗传学机制及对舌鳞癌生物学特性(包括增殖凋亡、周期进展、侵袭转移、血管新生等)的影响;3、舌鳞癌中失调基因可否作为治疗靶点或肿瘤抗原来开发新的肿瘤治疗方案或药物。随着癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)计划的完成,大量的舌鳞癌中的失调表达基因被鉴定出来,并对其功能进行了详细功能研究,而作为基因组“暗物质”的非编码RNA,在舌鳞癌中的研究较少。这些非编码RNA如何调控相关基因表达并对参与调控肿瘤的生长、迁移、侵袭等过程尚未全部阐明。LncRNA是一类功能性的非编码RNA,它广泛的参与生物体的生长、发育、衰老、死亡等过程。近年来的研究发现,LncRNA参与了多种病理、生理学过程,并在其中扮演重要作用。在肿瘤发生发展中,失调表达的Lnc RNA广泛参与了PI3K/AKT、MAPK等信号通路,直接调控肿瘤的恶性生物学行为。此外,LncRNA可以通过影响表观修饰、转录调控及转录后调控实现其生物学功能。在肿瘤组织中,目前已发现有一系列的LncRNA表达失调并与肿瘤的发生发展密切相关,例如肝癌、肺癌、前列腺癌。然而,LncRNA在舌癌中的表达情况和功能研究仍鲜有报道。本研究主要针对在舌鳞癌中表达失调的LncRNA作进一步的筛选,选出与舌鳞癌发生发展密切相关的LncRNA,并探讨其对舌鳞癌发生发展的影响,研究其具体的作用功能和分子机制,以及探究其作为潜在的治疗靶点的可行性。本研究主要从以下三个方面来实施并完成。第一部分:舌鳞癌中差异表达的LncRNA的筛选。通过Affymetrix HTA芯片检测两对舌鳞癌及其癌旁组织中LncRNA表达谱差异。癌组织与癌旁组织相比,癌组织中有281个LncRNAs表达上调,286个LncRNAs表达下调(FoldChange2)。我选取其中显著差异表达的6个LncRNA设计qRT-PCR引物,在15对样本中验证LncRNAs的表达情况,结果提示6个LncRNA在舌鳞癌样本中均存在差异表达,其中linc00152差异较为显著,在73.3%(11/15)的舌鳞癌组织中高表达。且有既往研究表明linc00152在胃癌和结肠癌中促进肿瘤的增殖,并提示不良预后,但该研究舌鳞癌中没有相关报道,根据芯片结果和肿瘤样本中LncRNA表达情况的验证结果提示LncRNA可能在舌鳞癌的发生发展中具有重要作用。因此在接下来的研究中,重点研究linc00152。第二部分:linc00152对肿瘤细胞生物学行为的影响。在此部分中本课题通过体内、体外实验探究了linc00152的生物学功能。首先通过核质分离试剂盒分离细胞核和细胞质并抽提RNA,以GAPDH和U6为内参通过qPCR验证Linc00152的细胞定位,结果表明成熟的linc00152主要富集于细胞质。进一步,通过RACE实验结合Sanger测序明确了linc00152的成熟序列。之后,根据该序列设计干扰RNA(s i-linc00152)敲低linc00152在SCC-9和CAL-27中的表达;同时构建pcDNA3.1-li nc00152过表达质粒,用以在SCC-9和Cal-27细胞系中过表达该LncRNA。通过在SCC-9和Cal-27细胞干预linc00152表达研究其对舌鳞癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭等生物学行为的影响。CCK-8检测结果提示linc00152过表达可促进舌鳞癌细胞生长,敲减其表达可抑制细胞生长;通过Transwell和划痕实验表明,linc00152过表达可促进舌鳞癌细胞迁移;覆盖基质胶的Transwell实验表明linc00152过表达可增强舌鳞癌细胞的侵袭能力;通过PI标记后,FACS检测linc00152敲减对细胞周期的影响,实验结果表明linc00152过表达会使更高比例的舌鳞癌细胞由静止期(G0/G1期)进入分裂期(S期);顺铂诱导凋亡实验显示,linc00152过表达显著增加舌鳞癌细胞的抗凋亡能力。在裸鼠皮下成瘤实验中,因未能成功构建linc00152的稳定过表达株和敲除细胞株,未能观察到linc00152在体对肿瘤生长的影响,因此其体内功能有待于进一步研究。第三部分:linc00152的分子机制研究。为研究linc00152在舌鳞癌中发挥功能的分子机制,利用了双荧光素酶报告体系结合qRT-PCR、WB等技术检测linc00152发挥生物学效应的分子基础。在论文第二部分中,通过细胞核质分离实验证实li nc00152主要定位于细胞质中。大量既往研究表明细胞质中的LncRNAs可以通过“分子海绵”的方式来实现生物学功能。在Starbase数据库(http://starbase.sysu.edu.cn/mirLncRNA)中预测了可与linc00152结合的miRNA,结果显示linc00152与miR-193a-3p,miR-193b-3p,miR-376c-3p等有结合位点。之前在结肠癌中的研究也表明,linc00152可以作为竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA),与mi R-193a-3p结合,抑制miR-193a-3p功能,从而发挥基因表达调控作用。而ceRNA网络发挥作用的前提是作为中介的miRNA必须达到足够丰度。因此通过qRT-PCR检测miR-193a-3p,miR-193b-3p,miR-376c-3p在舌鳞癌细胞中的相对表达情况,结果显示发现miR-193b-3p在舌鳞癌中表达丰度较高,linc00152在舌鳞癌中最有可能竞争性的抑制miR-193b-3p来实现生物学功能。进一步通过双荧光素酶报告体系,将miR-193b-3p拟似物与报告质粒共转染293T细胞,以无关序列作为阴性对照,结果显示miR-193b-3p能够显著抑制报告质粒的荧光素酶表达;而miR-193b-3p与linc00152结合位点突变后,荧光素酶表达不再受抑制。通过TargetScan数据库,在舌鳞癌细胞系中干预linc00152后检测miR-193b-3p的靶基因c-kit的表达情况,发现linc00152表达量与c-kit正相关,过表达该LncRNA可介导c-kit的mRNA表达增加,抑制该LncRNA后c-kit的表达降低,因此linc00152在舌鳞癌中与c-kit竞争性结合miR-193b-3p,构成ceRNA网络。因为c-kit位于PI3K-AKT信号通路上游,通过Western-blot检测敲减linc00152表达后PI3K-AKT信号通路的活化情况,结果提示过表达linc00152可增强PI3K-AKT信号通路的活化,敲减linc00152表达后PI3K-AKT信号通路被抑制,因此linc00152作为竞争性内源RNA分子可通过miR-193b-3p与c-kit协同表达,从而调控PI3K-AKT信号通路,linc00152在舌鳞癌中的上调可促进舌鳞癌的发展。总之,通过以上四部分实验,本课题研究了在肿瘤样本中异常表达的Linc00152对肿瘤细胞增殖、凋亡、周期、侵袭迁移方面的影响,初步探讨了Linc00152作为竞争性的内源RNA进而调控PI3K-AKT信号通路的作用机制,掌握了在舌鳞癌中LncRNA研究的体系,为进一步深入了解和认识LncRNA与舌鳞癌的之间的关系打下了基础。
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R739.86

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1 李洪娇;Linc00152在舌鳞癌恶性生物学行为中的作用与机制研究[D];第二军医大学;2017年
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