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《第二军医大学》 2017年
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MiR-1254下调PSMD10抑制结直肠癌细胞迁移的机制研究

褚以忞  
【摘要】:【研究背景及目的】结直肠癌(colorectal cancer,CRC)的死亡率高和预后不良与肿瘤细胞的迁移和侵袭密切相关,多种基因和信号通路参与调控。其中最为关键的信号通路之一是上皮细胞间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT),该过程能够剥夺肿瘤细胞与邻近细胞紧密结合的能力,使肿瘤细胞能够在全身范围内迁移并且形成肿瘤转移灶。因此研究如何阻止EMT的发生、发展对于抑制结直肠癌细胞的转移具有重要意义。微小RNA(micro RNA,mi RNA)是一类小的非编码RNA(19-25核苷酸,nucleotides,nt),能够结合信使RNA(Messenger RNA,m RNA)的3’-非翻译区域(3’-untranslated region,3’UTR),通过转录后调控基因的表达而起作用。许多mi RNA都被证实参与了EMT的过程。mi R-1254是最近才被研究的一个mi RNA,其表达及功能在不同肿瘤中不尽相同,说明mi R-1254的功能是细胞特异性的,而这个mi RNA在结直肠癌中的作用尚未见报道,同样地,其在细胞迁移中所涉及的具体机制也不明确。本研究通过检测结肠癌样本中mi R-1254的表达,旨在探讨mi R-1254在结直肠癌转移中的重要作用及其分子机制,评估其作为结肠癌转移及诊断标志物和治疗靶点的可行性。【实验方法】一、检测mi R-1254在结直肠癌及癌旁组织中的表达。提取21例结直肠癌及癌旁组织的全RNA,通过real-time PCR检测mi R-1254中的表达情况。二、检测mi R-1254在结直肠癌细胞中的功能。为研究mi R-1254在结直肠癌细胞中的作用,利用transwell检测细胞的迁移,利用CCK8检测细胞增殖,通过流式细胞术检测细胞周期。三、检测mi R-1254对PSMD10的直接调控作用。综合RNA-seq以及生物信息学分析结果,找到了mi R-1254可能的下游靶基因PSMD10,通过real-time PCR以及western blot验证两者的关系。构建含有预测与mi R-1254相结合的PSMD10-3’UTR的报告基因质粒,以及相应的突变位点质粒,与mi R-1254 mimics/NC共转HEK-293T细胞,利用双荧光素酶报告基因系统验证mi R-1254对PSMD10的直接调控作用。四、检测mi R-1254通过调控PSMD10抑制结直肠癌细胞的迁移。通过real-time PCR检测PSMD10在结直肠癌及癌旁组织中的表达,并比较与mi R-1254表达的相关性。结直肠癌细胞株中下调PSMD10表达,通过transwell实验检测细胞迁移的变化。在过表达mi R-1254的稳转细胞株中,同时过表达PSMD10,通过transwell实验检测细胞迁移能力的变化,并进一步利用real-time PCR以及western blot检测两者是否参与EMT过程。五、探索mi R-1254在结直肠癌调控的差异表达基因和信号通路。在SW1116中瞬转mi R-1254 mimics/NC后,提取细胞全RNA做RNA测序分析(RNA-seq analysis),筛选出受mi R-1254调控的差异表达基因,由生物信息学分析这些差异基因所涉及的信号通路和蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络。六、利用统计学方法分析实验相关数据。实验数据采用软件SPSS 21.0进行分析,组间的两两比较利用配对样本t-test检验,方差非齐性则采用非参数检验,PSMD10与mi R-1254在结直肠组织中的相关统计采用回归分析。P0.05表明差异有统计学意义。【实验结果】一、mi R-1254在结直肠癌组织中较癌旁组织表达下调。与相应的癌旁组织比较,发现mi R-1254在80.95%(17/21)的结直肠癌组织中表达下调,另有19.05%(4/21)的癌组织中表达变化不明显或表达稍增加(P0.001)。二、mi R-1254能抑制结直肠癌细胞迁移,但对细胞增殖和细胞周期无明显作用。过表达mi R-1254的SW1116以及HCT116细胞相较NC组的迁移明显减少,说明mi R-1254能够抑制结直肠细胞迁移(P分别为0.001和0.05)。然而,过表达mi R-1254后对两个细胞系的增殖及细胞周期均无明显影响作用(P0.05)三、mi R-1254能够下调PSMD10的表达。在SW1116细胞中过表达mi R-1254,相应的RNA-seq分析结果中,找到了表达下调的基因PSMD10。通过real time RT-PCR以及western blot验证PSMD10的m RNA以及蛋白水平在过表达SW1116和HCT116细胞中均明显下调(P0.001)。四、上调mi R-1254表达抑制PSMD10-3’UTR报告基因的荧光素酶活性。上调mi R-1254表达后,带有PSMD10-3’UTR报告基因的荧光素酶活性下降58.5%(P0.05),而结合位点突变的PSMD10-mut-3’UTR报告基因质粒的荧光素酶活性则无明显变化,提示mi R-1254通过结合PSMD10 3’UTR以调控后者。五、PSMD10在结直肠癌组织中表达与mi R-1254呈负相关。相较癌旁组织,76.19%(16/21)的癌组织中PSMD10表达明显升高;与上文中在组织中检测的mi R-1254表达水平一起做回归分析,两者表达呈负相关(R2=0.5430,P0.001)。六、下调PSMD10表达能够抑制结直肠癌细胞迁移,而过表达PSMD10能够削弱mi R-1254对结直肠癌迁移的抑制作用。下调PSMD10表达,SW1116以及HCT116细胞迁移数量较对照组明显减少(P0.001),而过表达PSMD10,能促进结直肠癌细胞迁移,同时削弱mi R-1254对结直肠癌迁移的抑制作用。七、mi R-1254作用PSMD10从而调控EMT影响结直肠癌细胞的迁移。在结肠癌细胞中上调mi R-1254表达,上皮表型E-cadherin表达上调;而转录因子Snail以及间质表型N-cadherin、Vimentin等在RNA及蛋白水平表达下调;若在过表达mi R-1254的细胞中同时上调PSMD10,上述mi R-1254所致的表达变化均被削弱。八、mi R-1254在结直肠癌中调控的差异基因和涉及的信号通路。通过RNA-seq,筛选出了217条DEGs,其中121条下调基因,96条上调基因。根据生物信息学分析,发现这些基因主要富集在p53信号通路、氨酰-t RNA生物合成、内吞、甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢以及N-聚糖生物合成等信号通路中;并分析了PPI,找到了5个中心节点蛋白为UMPS(Uridine 5'-monophosphate synthase)、EGR1(Early growth response protein 1)、CDKN1A(Cyclin-dependent kinase inhibitor 1)、YARS(Tyrosine-t RNA ligase)以及ASNS(asparagine synthetase),对今后研究mi R-1254影响结直肠癌发生的机制有指导性意义,并为临床诊断和治疗提供了建设性的研究方向。【结论】mi R-1254通过下调PSMD10从而影响EMT过程而抑制结直肠癌细胞的迁移。
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R735.34

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