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《第二军医大学》 2017年
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Nav1.8介导大鼠痛觉传入的细胞与分子机制研究

程志军  
【摘要】:【研究目的】疼痛是一种较为常见的临床症状,可严重影响患者的生活质量。近年来随着各种疼痛动物模型的建立,对疼痛形成机制的研究也逐渐深入。目前的研究认为电压门控钠离子通道在疼痛通路中起重要的作用,其不同的亚型,功能的紊乱和表达异常是产生疼痛的重要机制。河豚毒素不敏感型(TTX-R)电压门控钠离子通道Nav1.8在其中作用重要,因而成为许多疼痛机制研究的重点。目前比较稳定的动物模型有:BmK I疼痛模型,BmK I是从东亚钳蝎(Buthus martensi Karsch)毒素中提纯得到的单一成分,可以用来模拟自发痛现象,具有持续时间相对较短,呈现单相行为学曲线的特点,能够较好地简化模拟临床相关病征。BmK I疼痛模型独有痛觉大发作现象,是研究临床阵发痛机制很好的载体。随着近年来以Walker256乳腺癌细胞株建立的大鼠骨癌痛模型的稳定,骨癌痛的机制研究也越发深入。临床上也发现草乌甲素可能通过调控钠离子通道的电生理特性达到临床镇痛效果。那么这些疼痛的发生与药物的镇痛作用是否与Nav1.8有关呢?本研究拟采用BmK I疼痛模型和Walker256乳腺癌细胞株建立的大鼠骨癌痛模型,以行为学检测、实时定量PCR、免疫组化技术系统地研究电压门控钠通道亚型Nav 1.8在大鼠背根神经节的表达和分布情况,了解此类疼痛形成的钠通道机制;并以全细胞膜片钳技术记录和分析草乌甲素灌流下Nav1.8电流特性的改变,探讨钠通道Nav1.8在痛觉传入中的电生理机制。【研究方法】一、电压门控钠离子通道Nav1.8在BmK I疼痛模型的作用机制成年雄性SD大鼠(Sprague-Dawley)12只,随机分为实验组和对照组2组,每组6只,实验组SD大鼠左后足足底皮下注射BmK I(10μg/50μl),建立疼痛模型。选择在2小时观察自发痛反应,4小时和8小时观察机械痛觉过敏和热痛觉过敏。以Rt–PCR和免疫组化技术研究电压门控钠通道亚型Nav 1.8在大鼠背根神经节的表达和分布情况。二、电压门控钠离子通道Nav1.8在骨癌痛模型的作用机制30只雌性Wistar清洁级大鼠,随机分为三组:癌痛模型组(Walker256组,n=10),假手术组(Sham组,n=10),空白对照组(Control组,n=10),胫骨内接种Walker 256细胞,建立大鼠骨癌痛模型,观察其体重、行走、机械性痛觉阈值和热痛觉阈值变化,并行影像学检查和病理检查,以RT-PCR和免疫组化技术研究电压门控钠通道亚型Nav 1.8在大鼠背根神经节的表达和分布情况。三、钠离子通道阻滞剂草乌甲素对Nav1.8的调控作用大鼠DRG细胞急性分离后,分为对照组和草乌甲素(BLA)灌流组,每组6个,全细胞膜片钳记录Nav1.8的钠离子电流,两组细胞外液钧含有500nmol/L的河豚毒素,DRG细胞保持钳制于-60mV,草乌甲素组以10μM的BLA持续灌流。【结果】一、电压门控钠离子通道Nav1.8在BmK I疼痛模型的作用机制大鼠足底皮下注射10μg BmK I,(1)可诱导大鼠注射侧足底产生长达2 h的自发痛,长时程的机械痛敏和热痛敏现象;(2)实时定量PCR及免疫印迹实验数据表明,Nav1.8亚型的mRNA表达水平均呈现明显的时程相关性上调,(3)荧光双标结果显示,Nav1.8与N52、CGRP、IB4的共标率都呈时程相关性变化。二、电压门控钠离子通道Nav1.8在骨癌痛模型的作用机制癌痛组大鼠术后体重下降。影像学结果提示,术后21天大鼠胫骨骨质破坏。病理检查可见骨质破坏和增生,胫骨内有肿瘤生长,充满大量的肿瘤细胞。自由行走痛行为评分,癌痛模型组(W组)在D12时不再下降并有所上升,在D16和D20时,评分与假手术组(S组)和空白对照组(C组)比较差异有明显统计学意义(P0.01)。从D4到D20,癌痛模型组(W组)机械刺激缩足反应阈值在每个观察时间点均低于空白对照组(C组)大鼠机械刺激缩足反应阈值,差异有统计学意义(P0.05)。从D4到D12,假手术组(S组)机械刺激缩足反应阈值低于空白对照组(C组),差异有统计学意义(P0.05)。从D4开始癌痛模型组(W组)热刺激缩足反应阈值在每个观察时间点均低于空白对照组(C组)大鼠热刺激缩足反应阈值。差异有统计学意义(P0.05)。仅D4和D8,假手术组(S组)热刺激缩足反应阈值低于空白对照组(C组),差异有统计学意义(P0.05)。在癌痛模型组大鼠手术接种侧DRG上,Nav1.8(W:134.95±4.24)的mRNA水平的表达明显上调,与其他各组比较差异具有统计学意义(P0.05)。免疫荧光染色蛋白表达相同。三、钠离子通道阻滞剂草乌甲素对Nav1.8的调控作用以10μM BLA灌流后,稳态激活时,Nav1.8峰钠电流减小,差异具有统计学意义(P0.05),稳态失活时Nav1.8峰钠电流无变化。稳态激活时Nav1.8的IV曲线和GV曲线向超极化方向偏移;稳态失活时的GV曲线向超极化方向偏移,差异均无统计学意义(P〉0.05),。持续灌流10min后,Nav1.8电流开始减小,而曲线斜率因子均无变化。【结论】Nav1.8在BmK I疼痛模型中,对痛的诱发和维持均有显著的调节作用。另外,Nav1.8在不同类型的DRG神经元细胞上呈现不同的调节方式,这为进一步研究Nav1.8在BmK I疼痛模型中的靶向作用机制提供了依据。胫骨注射Walker 256乳腺癌细胞株,可产生癌瘤及骨癌痛。钠离子通道Nav1.8mRNA在DRG神经元细胞上显著上调,提示Nav1.8参与了大鼠骨癌痛的形成,且提示外周小神经元的变化在骨癌痛的形成中更为重要。草乌甲素在10μM浓度下,对稳态激活的Nav1.8峰钠电流有抑制作用,对Nav1.8的其他电生理特性无调控作用。
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R402

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