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《第二军医大学》 2017年
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UbcH10在多发性骨髓瘤细胞对硼替佐米耐药中的作用和机制研究

奚昊  
【摘要】:多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)是一种血液系统的浆细胞性恶性肿瘤,好发于中老年人群,中位生存期仅为3~4年。近年来随着蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Bortezomib,BTZ)为代表新药的出现,针对MM的治疗逐渐显示出较好的疗效,BTZ已经成为诸多治疗指南中的一线用药。但是尽管如此,硼替佐米仍然不能改变MM患者不能被治愈的结局。绝大多数患者对硼替佐米初次化疗敏感,但随着病程延长,最终还是出现复发或耐药的情况。因此,研究MM细胞产生对硼替佐米耐药的机制,是目前骨髓瘤治疗研究领域的一个热点。Ubc H10是泛素结合酶E2C(Ubiquitin-conjugating protein E2,UBE2C)基因家族成员,是人体内泛素/蛋白酶体途径(UPP)的关键成员之一,通过UPP途径发挥其重要的生物学作用。研究证实,细胞内80~90%的蛋白通过UPP途径降解,而蛋白酶体抑制剂-硼替佐米(BTZ)正是主要通过泛素/蛋白酶体途径途径发挥抗骨髓瘤作用的,如果要准确深入的理解MM细胞对其的耐药机制,必须要深入研究UPS途径相关的蛋白降解异常情况。此外,大量研究结果显示,微RNA(micro RNA,mi RNA)在肿瘤发生发展的过程中有着重要作用。而且,研究显示不仅mi RNA分子与肿瘤转移有关,而且与肿瘤细胞对药物耐药性的关系密切。因此,研究耐药肿瘤细胞中mi RNA的差异表达以及与耐药相关基因之间的调控关系,对阐明耐药机制具有重要意义。本研究分为三个部分:(一)通过检测MM细胞株、硼替佐米耐药MM细胞株中Ubc H10基因m RNA及蛋白含量,研究分析Ubc H10与MM细胞对硼替佐米耐药性之间相关性。(二)建立基因干扰模型,采用小干扰RNA的方法沉默多发性骨髓瘤细胞中的Ubc H10基因表达,研究基因沉默后多发性骨髓瘤细胞增殖活性及凋亡等生物学特性的变化情况。(三)通过生物信息学的方法预测以Ubc H10为靶基因的mi RNAs,通过荧光素酶报告基因验证mi RNAs与Ubc H10的结合位点。通过干预相关mi RNAs表达,观察细胞内Ubc H10及耐药相关蛋白MDR1蛋白含量变化情况,寻找通过调控Ubc H10的表达,进而影响骨髓瘤细胞对硼替佐米耐药的可能机制。第一部分泛素结合酶E2/Ubc H10在多发性骨髓瘤细胞株及耐药细胞株的表达情况目的:检测MM细胞株、硼替佐米耐药MM细胞株中Ubc H10基因m RNA及蛋白含量,研究分析Ubc H10与MM细胞对硼替佐米耐药性之间相关性。方法:以正常浆细胞为对照,应用RT-PCR法及蛋白免疫印迹法检测5株MM细胞(U-1996,U-266,MM.1S,NCI-H929和RPMI8226)中Ubc H10基因的m RNA和蛋白的基础表达情况。采用药物浓度递增法,建立硼替佐米耐药细胞株并验证。应用RT-PCR法及蛋白免疫印迹法检测耐药细胞株和其亲本细胞株中Ubc H10基因的m RNA和蛋白的表达情况,研究其差异情况。结果:与正常浆细胞相比较,多发性骨髓瘤U-1996,U-266,MM.1S,NCI-H929和RPMI8226细胞中Ubc H10 m RNA含量明显升高,分别为4.131±0.373(P=0.001),4.950±0.428(P0.001),6.086±0.606(P0.001),8.581±0.767(P0.001),4.278±0.480(P=0.001)。与正常浆细胞相比较,多发性骨髓瘤U-1996,U-266,MM.1S,NCI-H929和RPMI8226细胞中Ubc H10蛋白表达水平明显升高,差异具有统计学意义(P0.01)。成功诱导得到三株耐药细胞株U-266/BTZ,NCI-H929/BTZ和RPMI-8226/BTZ,48小时对BTZ的IC50值分别为55.62±4.88n M,49.12±4.32n M和61.21±5.82n M,与其亲本细胞的11.10±1.24n M,6.08±0.71n M和10.02±1.62n M相比,耐药细胞与亲本细胞之间IC50值差异具有统计学意义(P0.01)。应用RT-PCR法及蛋白免疫印迹法检测耐药细胞株和其亲本细胞株中Ubc H10基因的m RNA和蛋白的表达情况,结果显示耐药MM细胞中Ubc H10蛋白含量明显高于亲本细胞株(P0.05);而m RNA含量虽然具有与Ubc H10蛋白相同的趋势,但是耐药细胞与其亲本细胞之间差异并无统计学意义(P0.05)。结论:Ubc H10基因在MM细胞株存在m RNA和蛋白水平的表达,与正常浆细胞相比较含量明显升高。耐药细胞株中Ubc H10蛋白含量较之其亲本细胞明显升高,差异有统计学意义;而m RNA略有升高,差异无统计学意义。第二部分基因沉默Ubc H10表达对多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡的作用研究目的:通过采用小干扰RNA(si RNA)的方法沉默多发性骨髓瘤细胞中Ubc H10基因的表达,研究将该基因沉默后多发性骨髓瘤细胞增殖及凋亡等生物学特性的变化情况。方法:根据Ubc H10基因信息,设计针对Ubc H10基因CDS区的si RNA序列及其错配序列。通过Lipofectamine2000转染系统,转染相关si RNA序列至多发性骨髓瘤U-1996细胞。在转染si RNA后48 h,应用RT-PCR法及蛋白免疫印迹法检测U-1996细胞中Ubc H10基因的m RNA和其蛋白表达水平的情况,并与转染前的结果进行对比。选取未转染si RNA序列的空白组和转染阴性si RNA序列组作为实验对照,采用CCK-8法检测转染si RNA序列24、48、72h后U-1996细胞增殖的情况,采用流式细胞术的方法检测转染si RNA序列48h后U-1996细胞的凋亡情况。结果:应用Lipofectamine2000转染系统,成功将构建的Ubc H10的si RNA序列转染至U-1996细胞。经RT-PCR和蛋白免疫印迹法检测,转染后的U-1996细胞中Ubc H10基因的m RNA及蛋白表达情况较之转染前均明显下降(P0.05)。转染48h后,和空白组和对照组相比,沉默Ubc H10基因表达后的U-1996细胞增殖活力明显下降(P0.05),细胞凋亡率明显上升(P0.01),差异具有统计学意义。结论:干扰Ubc H10基因表达可显著抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖活性并增加细胞凋亡。第三部分hsa-mi R-631通过抑制Ubc H10逆转MM细胞对硼替佐米耐药的作用机制研究目的:明确hsa-mi R-631在多发性骨髓瘤对硼替佐米耐药细胞株中的作用,分析其影响细胞耐药的调控机制。方法:使用硼替佐米药物浓度梯度法诱导建立耐药骨髓瘤细胞株U-266/BTZ,NCI-H929/BTZ和RPMI-8226/BTZ,采用实时定量PCR法及蛋白免疫印迹法检测耐药细胞及其亲本细胞中hsa-mi R-631与Ubc H10蛋白含量。应用生物信息学方法,预测Ubc H10基因3’UTR区是存在hsa-mi R-631的理论结合位点,并通过荧光素酶报告基因实验进行结合位点验证。通过慢病毒实验系统,在三株耐药细胞株分别及共同过表达has-mi R-631以及外源性Ubc H10,分为对照组(control)、Lv-Control、Lv-mi R631、Lv-Ubc H10、Lv-mi R631+Lv-Ubc H10五组,然后使用一定浓度硼替佐米处理细胞48小时,CCK-8法检测各组细胞活性,求得细胞对于硼替佐米的IC50值,并采用流式细胞术检测细胞凋亡率。在耐药细胞株中过表达has-mi R-631,检测耐药相关蛋白MDR1含量变化。结果:与原代细胞株比较,U-266/BTZ,NCI-H929/BTZ和RPMI-8226/BTZ三株细胞中,Ubc H10蛋白含量均明显升高,而has-mi R-631相对含量则明显降低。其中,蛋白含量分别为原代细胞蛋白含量的3.12±0.35,5.22±0.63和4.31±0.52倍,组间差异显著(P0.05),has-mi R-631 mRNA含量分别下降至亲本细胞的0.41±0.04,0.25±0.03和0.34±0.03倍,组间差异显著(P0.05)。生物信息学及荧光素酶实验证实has-mi R-631通过种子区5’-CAGGUCA-3’与Ubc H10基因3’UTR区结合,并抑制Ubc H10基因翻译。我们通过慢病毒途径在三株耐药细胞株中进行了基因干预实验,通过绿色荧光蛋白表达判断,基因转到接近于100%。实时定量PCR检测结果显示,Lv-mi R631感染耐药细胞后,细胞中mi R631成熟体含量明显升高,耐药细胞株与其亲本细胞比较,均有显著差异(P0.01)。蛋白免疫印迹法检测结果显示,Lv-mi R631组细胞Ubc H10蛋白含量明显降低(P0.01,vs对照组);Lv-Ubc H10组细胞Ubc H10蛋白含量明显增强(P0.01,vs对照组);Lv-mi R631+Lv-Ubc H10组细胞内Ubc H10蛋白含量亦明显增强(P0.01,vs对照组),与Lv-Ubc H10组无明显差异(P0.05),与Lv-mi R631组比较,显著升高(P0.05)。MDR1蛋白变化趋势则与Ubc H10完全一致。通过慢病毒实验系统,在三株耐药细胞株在三株耐药细胞株分别及共同过表达has-mi R-631以及外源性Ubc H10,分为control、Lv-Control、Lv-mi R631、Lv-Ubc H10、Lv-mi R631+Lv-Ubc H10五组,结果显示U-266/BTZ,NCI-H929/BTZ和RPMI-8226/BTZ三株细胞中的Lv-mi R631组对于硼替佐米的IC50(48h)值显著下降,组间差异具有统计学意义(P0.01)。流式细胞术检测U-266/BTZ各组细胞的凋亡率,结果分别为:control 24.63±3.02%;Lv-Control 23.96±2.87%;Lv-mi R631 86.13±6.45%;Lv-Ubc H10 18.73±3.92%;Lv-mi R631+Lv-Ubc H10 19.97±2.14%。Lv-mi R631组的凋亡率显著高于其他各组,差异具有统计学意义(P0.01),而其余四组之间无显著差异。在耐药细胞株中过表达hsa-mi R-631,使用MG132抑制蛋白降解后,Lv-mi R631对MDR1的影响作用和对照组无明显差异。而使用CHX抑制蛋白合成后,Lv-mi R631组MDR1蛋白含量下降的程度和对照组有显著差异。结论:hsa-mi R-631通过抑制其靶基因Ubc H10的表达来逆转多发性骨髓瘤细胞对硼替佐米的耐药性。
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R733.3

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